Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung quantitativer Daten über die antimykotische Aktivität von Peptiden und anderen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularen Antimykotika, gegen Candida albicans. Die Verwendung der optischen Dichte anstelle der Zählung koloniebildender Einheiten zur Quantifizierung der Wachstumshemmung spart Zeit und Ressourcen.
Abstract
Herkömmliche Methoden zur Durchführung von antimykotischen Empfindlichkeitstests für Candida albicans sind zeitaufwändig und es fehlen quantitative Ergebnisse. Ein gängiger Ansatz beruht beispielsweise darauf, Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen antimykotischer Moleküle behandelt wurden, auf Agarplatten zu plattieren und dann die Kolonien zu zählen, um die Beziehung zwischen Molekülkonzentration und Wachstumshemmung zu bestimmen. Diese Methode erfordert viele Platten und viel Zeit, um die Kolonien zu zählen. Ein anderer gängiger Ansatz eliminiert die Platten und das Zählen von Kolonien, indem mit Antimykotika behandelte Kulturen visuell inspiziert werden, um die Mindestkonzentration zu ermitteln, die zur Hemmung des Wachstums erforderlich ist. Die visuelle Inspektion liefert jedoch nur qualitative Ergebnisse, und Informationen über das Wachstum bei subinhibitorischen Konzentrationen gehen verloren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der Empfindlichkeit von C. albicans gegenüber antimykotischen Peptiden. Durch die Verwendung optischer Dichtemessungen von Kulturen reduziert die Methode den Zeit- und Materialaufwand, der benötigt wird, um quantitative Ergebnisse zum Kulturwachstum bei verschiedenen Peptidkonzentrationen zu erhalten. Die Inkubation des Pilzes mit Peptiden wird in einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines geeigneten Puffers durchgeführt, wobei die Kontrollen keine Wachstumshemmung und eine vollständige Wachstumshemmung darstellen. Nach der Inkubation mit dem Peptid werden die resultierenden Zellsuspensionen verdünnt, um die Peptidaktivität zu reduzieren, und dann über Nacht gezüchtet. Nach dem Wachstum über Nacht wird die optische Dichte jeder Vertiefung gemessen und mit den Positiv- und Negativkontrollen verglichen, um die resultierende Wachstumshemmung bei jeder Peptidkonzentration zu berechnen. Die Ergebnisse mit diesem Assay sind vergleichbar mit den Ergebnissen mit der traditionellen Methode der Beschichtung der Kulturen auf Agarplatten, aber dieses Protokoll reduziert den Plastikmüll und den Zeitaufwand für die Zählung der Kolonien. Obwohl sich die Anwendungen dieses Protokolls auf antimykotische Peptide konzentriert haben, wird die Methode auch auf die Untersuchung anderer Moleküle mit bekannter oder vermuteter antimykotischer Aktivität anwendbar sein.
Introduction
Candida albicans ist ein Mitglied der menschlichen Mikrobiota, die zahlreiche Stellen besiedelt, darunter die Mundhöhle, die Haut, den Magen-Darm-Trakt und die Vagina1. Bei Patienten, die aufgrund von Krankheiten wie dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) und immunsuppressiven Behandlungen immungeschwächt sind, kann die Besiedlung von C. albicans zu einer lokalen oder systemischen Candidose führen 2,3. Die Verwendung von derzeit verfügbaren niedermolekularen antimykotischen Therapeutika wie Amphotericin B, Azolen oder Echinocandinen kann durch Löslichkeits- und Toxizitätsprobleme sowie durch die Resistenz von Infektionen gegen die Therapeutikaerschwert werden 4,5. Aufgrund der Einschränkungen der derzeitigen Antimykotika suchen Forscher ständig nach neuen antimykotischen Molekülen, die gegen C. albicans wirksam sind.
Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind eine potenzielle Alternative zu den derzeitigen niedermolekularen Antimykotika 6,7,8 und gelten als weniger anfällig für die Entwicklung von Resistenzen im Vergleich zu niedermolekularen Arzneimitteln 9. AMPs sind eine vielfältige Gruppe von Peptiden, aber sie sind oft kationisch, mit einem breiten Wirkungsspektrum10,11,12. Zu den AMPs mit Aktivität gegen C. albicans gehören bekannte Peptide aus den Histatin- und Cecropin-Familien 13,14,15 sowie neuere beschriebene Peptide wie ToAP2, NDBP-5.7 und die Histatin-5-Variante K11R-K17R 16,17. Aufgrund ihres Potenzials zur Behandlung von Candida-Infektionen ist die Identifizierung und Entwicklung neuer AMPs, die auf C. albicans abzielen, ein wichtiges Ziel für viele Forschungsgruppen.
Als Teil des Prozesses zur Entwicklung wirksamer AMPs (und anderer Antimykotika), die auf C. albicans abzielen, werden häufig In-vitro-Tests verwendet, um vielversprechende Peptide zu identifizieren. Methoden zum Testen der antimykotischen Aktivität gegen C. albicans beinhalten typischerweise die Inkubation von Zellen mit seriellen Verdünnungen der AMPs (in Puffer oder Medium) in 96-Well-Platten. Es stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, um die antimykotische Aktivität nach der Inkubation zu beurteilen. Eine vom Clinical Laboratory Standards Institute beschriebene Technik verwendet eine rein visuelle Beurteilung der Trübung der Vertiefungen, um die Mindestkonzentration (MHK) für die vollständige Hemmung des Wachstums zu bestimmen (mindestens 50% Hemmung für ausgewählte Antimykotika wie Azole und Echinocandine) und liefert keine Quantifizierung des Wachstums bei Sub-MIC-Konzentrationen18 . Ein weiterer häufig verwendeter Ansatz besteht darin, die Lebensfähigkeit nach der Inkubation mit AMPs zu quantifizieren, indem der Inhalt der Vertiefungen auf Agarplatten plattiert, die Platten inkubiert und dann die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) auf der Platte gezählt wird. Diese Methode wurde zur Bewertung einer Reihe von Peptiden verwendet, darunter Histatin-5-basierte Peptide, LL-37 und humanes Lactoferrin 19,20,21. Diese Technik erfordert ein relativ großes Agarvolumen und eine hohe Anzahl von Platten und beinhaltet das mühsame Zählen von KBE auf den Platten. Um mehr quantitative Daten zu erhalten und gleichzeitig weniger Plastikmüll zu erzeugen und das Zählen von KBE zu vermeiden, kann der Inhalt der Vertiefungen verwendet werden, um frisches Medium in einer weiteren 96-Well-Platte zu impfen. Nach der Inkubation der neu beimpften Platte kann das Wachstum quantifiziert werden, indem die optische Dichte bei 600 nm (OD600) auf einem Absorptionsplattenleser gemessen wird. Diese Methode wurde verwendet, um die antimykotische Aktivität von Histatin 5 und seinen Abbaufragmenten und zelldurchdringenden Peptiden 17,22,23,24,25 zu bestimmen.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die antimykotische Aktivität von Peptiden getestet werden kann, und verwendet die OD600-Methode , um die Verringerung der Lebensfähigkeit von C. albicans aufgrund von Peptiden zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten Ansatz zur Gewinnung quantitativer Daten zur antimykotischen Aktivität von AMPs gegen den Pilzerreger C. albicans. Ein gängiger alternativer Ansatz zum Testen von Peptiden und anderen Antimykotika ist die Bouillon-Mikrodilution, die im Standard M2718 des Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) beschrieben ist, aber dieser Standard konzentriert sich auf die Erzielung qualitativer visueller Ergebnisse anstelle von quantitativen Ergebnis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), der National Science Foundation (CBET 1511718), dem Bildungsministerium (GAANN-P200A180093) und einem Cross-Campus Seed Grant der University of Maryland unterstützt.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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