칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 펩타이드의 항진균 활성 정량화
Summary
이 프로토콜은 칸 디다 알비칸스에 대한 펩타이드 및 소분자 항진균제와 같은 기타 화합물의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명합니다. 성장 억제를 정량화하기 위해 집락 형성 단위를 세는 대신 광학 밀도를 사용하면 시간과 자원을 절약할 수 있습니다.
Abstract
칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균성 감수성 검사를 수행하는 전통적인 방법은 시간이 많이 걸리고 정량적 결과가 부족합니다. 예를 들어, 일반적인 접근법은 한천 플레이트에 다양한 농도의 항진균 분자로 처리된 세포를 도금한 다음 콜로니를 계수하여 분자 농도와 성장 억제 사이의 관계를 결정하는 데 의존합니다. 이 방법은 식민지를 세는 데 많은 판과 상당한 시간이 필요합니다. 또 다른 일반적인 접근법은 성장을 억제하는 데 필요한 최소 농도를 확인하기 위해 항진균제로 처리된 배양물을 육안으로 검사하여 플레이트와 콜로니 계수를 제거합니다. 그러나 육안 검사는 정성적 결과만 생성하며 하위 억제 농도에서의 성장에 대한 정보는 손실됩니다. 이 프로토콜은 항진균 펩타이드에 대한 C. albicans의 감수성을 측정하는 방법을 설명합니다. 배양의 광학 밀도 측정에 의존함으로써 이 방법은 다양한 펩타이드 농도에서 배양 성장에 대한 정량적 결과를 얻는 데 필요한 시간과 재료를 줄입니다. 펩타이드를 사용한 곰팡이의 배양은 적절한 완충액을 사용하여 96웰 플레이트에서 수행되며, 대조군은 성장 억제 없음 및 완전한 성장 억제를 나타냅니다. 펩티드와 함께 배양한 후, 생성된 세포 현탁액을 희석하여 펩티드 활성을 감소시킨 다음 밤새 성장시킵니다. 하룻밤 성장 후, 각 웰의 광학 밀도를 측정하고 양성 및 음성 대조군과 비교하여 각 펩티드 농도에서 결과적인 성장 억제를 계산합니다. 이 분석을 사용한 결과는 한천 플레이트에 배양물을 도금하는 전통적인 방법을 사용한 결과와 비슷하지만 이 프로토콜은 플라스틱 폐기물과 집락 계수에 소요되는 시간을 줄입니다. 이 프로토콜의 적용은 항진균 펩타이드에 초점을 맞추었지만 이 방법은 항진균 활성이 알려지거나 의심되는 다른 분자를 테스트하는 데에도 적용할 수 있습니다.
Introduction
칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 구강, 피부, 위장관 및 질을 포함한 수많은 위치에 서식하는 인간 미생물총의 일원입니다1. 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 면역억제 치료와 같은 질병으로 인해 면역이 저하된 환자의 경우, C. albicans의 집락화는 국소 또는 전신 칸디다증을 유발할 수 있다 2,3. 암포테리신 B, 아졸 또는 에키노칸딘과 같은 현재 이용가능한 소분자 항진균 치료제의 사용은 용해도 및 독성 문제와 치료제에 대한 감염의 저항성에 의해 복잡해질 수 있다 4,5. 현재 항진균제의 한계로 인해 연구자들은 C. albicans에 대한 활성을 가진 새로운 항진균 분자를 지속적으로 찾고 있습니다.
항균 펩티드(AMP)는 현재의 소분자 항진균제6,7,8에 대한 잠재적인 대안이며, 소분자 약물9에 비해 내성 발달에 덜 민감한 것으로 제안된다. AMP는 다양한 펩타이드 세트이지만 종종 양이온성이며 광범위한 활성 스펙트럼을 가지고 있습니다10,11,12. C. albicans에 대한 활성을 가진 AMP에는 Histatin 및 cecropin 계열 13,14,15의 잘 알려진 펩타이드와 ToAP2, NDBP-5.7 및 히스타틴 5 변이체 K11R-K17R 16,17과 같은 최근에 설명된 펩타이드가 포함됩니다. 칸디다 감염을 치료할 수 있는 잠재력으로 인해 C. albicans를 표적으로 하는 새로운 AMP를 식별하고 설계하는 것은 많은 연구 그룹에서 중요한 목표입니다.
C. albicans를 표적으로 하는 효과적인 AMP(및 기타 항진균제)를 개발하는 과정의 일환으로, 체외 검사는 일반적으로 유망한 펩타이드를 식별하는 데 사용됩니다. C. albicans에 대한 항진균 활성을 테스트하는 방법은 일반적으로 96웰 플레이트에서 AMP(완충액 또는 배지)의 연속 희석액으로 세포를 배양하는 것을 포함합니다. 배양 후 항진균 활성을 평가하기 위해 몇 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 임상검사표준협회(Clinical Laboratory Standards Institute)에서 기술한 기술은 웰의 탁도를 시각적으로 평가하여 완전한 성장 억제(아졸 및 에키노칸딘과 같은 선택된 항진균제의 경우 최소 50% 억제)를 측정하며, MIC 이하 농도에서 성장을 정량화하지 않는다18 . 일반적으로 사용되는 또 다른 접근법은 한천 플레이트에 웰의 내용물을 도금하고 플레이트를 배양한 다음 플레이트의 집락 형성 단위(CFU) 수를 계산하여 AMP로 배양한 후 생존력을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 히스타틴 5계 펩티드, LL-37 및 인간 락토페린 19,20,21을 포함하는 다수의 펩티드를 평가하기 위해 사용되어 왔다. 이 기술은 상대적으로 많은 양의 한천과 많은 수의 플레이트가 필요하며 플레이트의 CFU를 지루하게 계산해야합니다. 플라스틱 폐기물을 줄이고 CFU 계산을 피하면서 더 많은 정량적 데이터를 얻기 위해 웰의 내용물을 사용하여 다른 96웰 플레이트에 새로운 배지를 접종할 수 있습니다. 새로 접종된 플레이트를 인큐베이션한 후, 흡광도 플레이트 판독기 상에서 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도를 측정함으로써 성장을 정량화할 수 있다. 이 방법은 히스타틴 5 및 그의 분해 단편 및 세포 침투 펩티드 17,22,23,24,25의 항진균 활성을 결정하는 데 사용되었습니다.
이 프로토콜은 펩타이드의 항진균 활성을 테스트하는 방법을 설명하고 OD600 방법을 사용하여 펩타이드로 인한 C. albicans 의 생존력 감소를 정량화합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 진균 병원체 C. albicans에 대한 AMP의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻기 위한 효율적인 접근 방식을 설명합니다. 펩타이드 및 기타 항진균제를 검사하는 일반적인 대안 접근법 중 하나는 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute)의 표준 M2718에 설명된 브로스 미세 희석이지만 이 표준은 정량적 결과 대신 정성적 시각적 결과를 얻는 데 중점을 둡니다. 또 다른 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (R03DE029270, T32AI089621B), 국립 과학 재단 (CBET 1511718), 교육부 (GAANN-P200A180093) 및 메릴랜드 대학교 크로스 캠퍼스 종자 보조금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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