Quantifier l’activité antifongique des peptides contre Candida albicans
Summary
Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique de peptides et d’autres composés, tels que des agents antifongiques à petites molécules, contre Candida albicans. Son utilisation de la densité optique plutôt que de compter les unités formant colonie pour quantifier l’inhibition de la croissance permet d’économiser du temps et des ressources.
Abstract
Les méthodes traditionnelles pour effectuer des tests de sensibilité antifongique pour Candida albicans prennent beaucoup de temps et manquent de résultats quantitatifs. Par exemple, une approche courante repose sur le placage de cellules traitées avec différentes concentrations de molécules antifongiques sur des plaques de gélose et sur le comptage des colonies pour déterminer la relation entre la concentration des molécules et l’inhibition de la croissance. Cette méthode nécessite de nombreuses plaques et beaucoup de temps pour compter les colonies. Une autre approche courante élimine les plaques et le comptage des colonies en inspectant visuellement les cultures traitées avec des agents antifongiques afin d’identifier la concentration minimale requise pour inhiber la croissance; Cependant, l’inspection visuelle ne produit que des résultats qualitatifs et les informations sur la croissance à des concentrations sous-inhibitrices sont perdues. Ce protocole décrit une méthode pour mesurer la sensibilité de C. albicans aux peptides antifongiques. En s’appuyant sur des mesures de densité optique de cultures, la méthode réduit le temps et les matériaux nécessaires pour obtenir des résultats quantitatifs sur la croissance des cultures à différentes concentrations de peptides. L’incubation du champignon avec des peptides est réalisée dans une plaque de 96 puits à l’aide d’un tampon approprié, avec des témoins ne représentant aucune inhibition de la croissance et une inhibition complète de la croissance. Après l’incubation avec le peptide, les suspensions cellulaires résultantes sont diluées pour réduire l’activité peptidique, puis cultivées pendant la nuit. Après une croissance nocturne, la densité optique de chaque puits est mesurée et comparée aux témoins positifs et négatifs pour calculer l’inhibition de la croissance résultante à chaque concentration peptidique. Les résultats obtenus à l’aide de ce test sont comparables à ceux obtenus selon la méthode traditionnelle de placage des cultures sur des plaques de gélose, mais ce protocole réduit les déchets plastiques et le temps passé à compter les colonies. Bien que les applications de ce protocole se soient concentrées sur les peptides antifongiques, la méthode sera également applicable aux tests d’autres molécules ayant une activité antifongique connue ou suspectée.
Introduction
Candida albicans est un membre du microbiote humain qui colonise de nombreux endroits, y compris la cavité buccale, la peau, le tractus gastro-intestinal et le vagin1. Pour les patients immunodéprimés en raison de maladies telles que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et les traitements immunosuppresseurs, la colonisation de C. albicans peut entraîner une candidose locale ou systémique 2,3. L’utilisation de produits thérapeutiques antifongiques à petites molécules actuellement disponibles, tels que l’amphotéricine B, les azoles ou les échinocandines, peut être compliquée par des problèmes de solubilité et de toxicité et par la résistance des infections aux produits thérapeutiques 4,5. En raison des limites des agents antifongiques actuels, les chercheurs sont continuellement à la recherche de nouvelles molécules antifongiques ayant une activité contre C. albicans.
Les peptides antimicrobiens (AMP) sont une alternative potentielle aux agents antifongiques actuels à petites molécules 6,7,8 et sont proposés pour être moins sensibles au développement de la résistance que les médicaments à petites molécules 9. Les AMPs sont un ensemble diversifié de peptides, mais ils sont souvent cationiques, avec un large spectre d’activité10,11,12. Les AMP ayant une activité contre C. albicans comprennent des peptides bien connus des familles de l’histatine et de la cécropine 13,14,15, ainsi que des peptides décrits plus récemment comme ToAP2, NDBP-5.7 et la variante de l’histatine 5 K11R-K17R 16,17. En raison de leur potentiel pour le traitement des infections à Candida, l’identification et la conception de nouveaux AMP qui ciblent C. albicans est un objectif important pour de nombreux groupes de recherche.
Dans le cadre du processus de développement d’AMP efficaces (et d’autres agents antifongiques) ciblant C. albicans, les tests in vitro sont couramment utilisés pour identifier les peptides prometteurs. Les méthodes pour tester l’activité antifongique contre C. albicans impliquent généralement l’incubation de cellules avec des dilutions en série des AMP (en tampon ou en milieu) dans des plaques à 96 puits. Plusieurs méthodes sont disponibles pour évaluer l’activité antifongique après l’incubation. Une technique décrite par le Clinical Laboratory Standards Institute utilise une évaluation purement visuelle de la turbidité des puits pour déterminer la concentration minimale (CMI) pour l’inhibition complète de la croissance (inhibition d’au moins 50 % pour certains agents antifongiques, comme les azoles et les échinocandines) et ne fournit aucune quantification de la croissance à des concentrations inférieures à la CMI18 . Une autre approche couramment utilisée consiste à quantifier la viabilité après l’incubation avec des AMP en plaquant le contenu des puits sur des plaques de gélose, en incubant les plaques, puis en comptant le nombre d’unités formant colonie (UFC) sur la plaque. Cette méthode a été utilisée pour évaluer un certain nombre de peptides, y compris les peptides à base d’histatine 5, LL-37 et lactoferrinehumaine 19,20,21. Cette technique nécessite un volume relativement important de gélose et un nombre élevé de plaques et implique le comptage fastidieux des UFC sur les plaques. Pour obtenir des données plus quantitatives tout en générant moins de déchets plastiques et en évitant de compter les UFC, le contenu des puits peut être utilisé pour inoculer le milieu frais dans une autre plaque de 96 puits. Après incubation de la plaque nouvellement inoculée, la croissance peut être quantifiée en mesurant la densité optique à 600 nm (OD600) sur un lecteur de plaque absorbante. Cette méthode a été utilisée pour déterminer l’activité antifongique de l’histatine 5 et de ses fragments de dégradation et peptides pénétrant dans les cellules 17,22,23,24,25.
Ce protocole décrit comment tester l’activité antifongique des peptides et utilise la méthode OD600 pour quantifier la réduction de la viabilité de C. albicans due aux peptides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une approche efficace pour obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique des AMP contre l’agent pathogène fongique C. albicans. Une approche alternative courante pour tester les peptides et autres agents antifongiques est la microdilution du bouillon décrite dans la norme M2718 du Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), mais cette norme se concentre sur l’obtention de résultats visuels qualitatifs plutôt que quantitatifs. Une autre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), la National Science Foundation (CBET 1511718), le ministère de l’Éducation (GAANN-P200A180093) et une subvention de démarrage intercampus de l’Université du Maryland.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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