Kwantificeren van de antischimmelactiviteit van peptiden tegen Candida albicans
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de antischimmelactiviteit van peptiden en andere verbindingen, zoals antischimmelmiddelen met kleine moleculen, tegen Candida albicans. Het gebruik van optische dichtheid in plaats van het tellen van kolonievormende eenheden om groeiremming te kwantificeren, bespaart tijd en middelen.
Abstract
Traditionele methoden voor het uitvoeren van antischimmelgevoeligheidstests voor Candida albicans zijn tijdrovend en missen kwantitatieve resultaten. Een gemeenschappelijke aanpak is bijvoorbeeld gebaseerd op het plateren van cellen die zijn behandeld met verschillende concentraties antischimmelmoleculen op agarplaten en vervolgens het tellen van de kolonies om de relatie tussen molecuulconcentratie en groeiremming te bepalen. Deze methode vereist veel platen en aanzienlijke tijd om de kolonies te tellen. Een andere veel voorkomende aanpak elimineert de platen en het tellen van kolonies door culturen die zijn behandeld met antischimmelmiddelen visueel te inspecteren om de minimale concentratie te identificeren die nodig is om de groei te remmen; visuele inspectie levert echter alleen kwalitatieve resultaten op en informatie over groei bij subremmende concentraties gaat verloren. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van de gevoeligheid van C. albicans voor antischimmelpeptiden. Door te vertrouwen op optische dichtheidsmetingen van culturen, vermindert de methode de tijd en materialen die nodig zijn om kwantitatieve resultaten te verkrijgen over cultuurgroei bij verschillende peptideconcentraties. De incubatie van de schimmel met peptiden wordt uitgevoerd in een 96-well plaat met behulp van een geschikte buffer, met controles die geen groeiremming en volledige groeiremming vertegenwoordigen. Na de incubatie met het peptide worden de resulterende celsuspensies verdund om de peptideactiviteit te verminderen en vervolgens ‘s nachts gekweekt. Na de nachtelijke groei wordt de optische dichtheid van elke put gemeten en vergeleken met de positieve en negatieve controles om de resulterende groeiremming bij elke peptideconcentratie te berekenen. De resultaten met behulp van deze test zijn vergelijkbaar met de resultaten met behulp van de traditionele methode om de culturen op agarplaten te platen, maar dit protocol vermindert plastic afval en de tijd die wordt besteed aan het tellen van kolonies. Hoewel de toepassingen van dit protocol zich hebben gericht op antischimmelpeptiden, zal de methode ook van toepassing zijn op het testen van andere moleculen met bekende of vermoedelijke antischimmelactiviteit.
Introduction
Candida albicans is een lid van de menselijke microbiota die tal van locaties koloniseert, waaronder de mondholte, huid, maagdarmkanaal en vagina1. Voor patiënten die immuungecompromitteerd zijn als gevolg van ziekten zoals humaan immunodeficiëntievirus (HIV) en immunosuppressieve behandelingen, kan de kolonisatie van C. albicans leiden tot lokale of systemische candidiasis 2,3. Het gebruik van momenteel beschikbare antischimmeltherapieën met kleine moleculen, zoals amfotericine B, azolen of echinocandinen, kan worden bemoeilijkt door oplosbaarheids- en toxiciteitsproblemen en door de resistentie van infecties tegen de therapeutica 4,5. Vanwege de beperkingen van de huidige antischimmelmiddelen zijn onderzoekers voortdurend op zoek naar nieuwe antischimmelmoleculen met activiteit tegen C. albicans.
Antimicrobiële peptiden (AMPs) zijn een potentieel alternatief voor de huidige antischimmelmiddelen met kleine moleculen 6,7,8 en worden voorgesteld minder gevoelig te zijn voor de ontwikkeling van resistentie in vergelijking met geneesmiddelen met kleine moleculen 9. AMPs zijn een diverse set peptiden, maar ze zijn vaak kationisch, met een breed spectrum van activiteit10,11,12. AMPs met activiteit tegen C. albicans omvatten bekende peptiden uit de histatine- en cecropinefamilies 13,14,15, samen met meer recent beschreven peptiden zoals ToAP2, NDBP-5.7 en de histatine 5-variant K11R-K17R16,17. Vanwege hun potentieel voor de behandeling van Candida-infecties, is het identificeren en ontwerpen van nieuwe AMPs die zich richten op C. albicans een belangrijk doel voor veel onderzoeksgroepen.
Als onderdeel van het proces om effectieve AMPs (en andere antischimmelmiddelen) te ontwikkelen die zich richten op C. albicans, wordt in vitro testen vaak gebruikt om veelbelovende peptiden te identificeren. Methoden om antischimmelactiviteit tegen C. albicans te testen, omvatten meestal het incuberen van cellen met seriële verdunningen van de AMPs (in buffer of medium) in 96-well platen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de antischimmelactiviteit na incubatie te beoordelen. Een techniek beschreven door het Clinical Laboratory Standards Institute maakt gebruik van een puur visuele beoordeling van de troebelheid van de putten om de minimale concentratie (MIC) te bepalen voor de volledige remming van de groei (ten minste 50% remming voor geselecteerde antischimmelmiddelen, zoals azolen en echinocandinen) en biedt geen kwantificering van de groei bij sub-MIC-concentraties18 . Een andere veelgebruikte benadering omvat het kwantificeren van de levensvatbaarheid na incubatie met AMPs door de inhoud van de putten op agarplaten te platen, de platen te incuberen en vervolgens het aantal kolonievormende eenheden (CFU’s) op de plaat te tellen. Deze methode is gebruikt voor het evalueren van een aantal peptiden, waaronder histatine 5-gebaseerde peptiden, LL-37 en humaan lactoferrine 19,20,21. Deze techniek vereist een relatief groot volume agar en een groot aantal platen en omvat het vervelende tellen van CFU’s op de platen. Om meer kwantitatieve gegevens te verkrijgen, terwijl minder plastic afval wordt gegenereerd en het tellen van CFU’s wordt vermeden, kan de inhoud van de putten worden gebruikt om vers medium in een andere 96-putplaat te enten. Na het incuberen van de nieuw geënte plaat kan de groei worden gekwantificeerd door de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) te meten op een absorptieplaatlezer. Deze methode is gebruikt om de antischimmelactiviteit van histatine 5 en zijn afbraakfragmenten en celdoordringende peptiden te bepalen 17,22,23,24,25.
Dit protocol beschrijft hoe de antischimmelactiviteit van peptiden kan worden getest en gebruikt de OD600-methode om de vermindering van de levensvatbaarheid van C. albicans als gevolg van peptiden te kwantificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een efficiënte aanpak voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de antischimmelactiviteit van AMPs tegen de schimmelpathogeen C. albicans. Een veel voorkomende alternatieve benadering voor het testen van peptiden en andere antischimmelmiddelen is de bouillonmicroverdunning die wordt beschreven in de standaard M2718 van het Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), maar deze standaard richt zich op het verkrijgen van kwalitatieve visuele resultaten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), de National Science Foundation (CBET 1511718), het Department of Education (GAANN-P200A180093) en een Cross-Campus Seed Grant van de Universiteit van Maryland.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , (2021).
- de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
- Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
- Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
- Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
- Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
- Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature’s reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
- Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
- Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
- Mercer, D. K., O’Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
- Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
- Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
- Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
- Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
- do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
- Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard – Third edition. , (2008).
- Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
- Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
- den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
- Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
- Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
- Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
- Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).
- Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022)
- Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
- Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
- Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d’Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
- Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van’t Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
- Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
- Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
- Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
- Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
- Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
