Количественная оценка противогрибковой активности пептидов против Candida albicans

Summary

В этом протоколе описан способ получения количественных данных о противогрибковой активности пептидов и других соединений, таких как низкомолекулярные противогрибковые средства, против Candida albicans. Использование оптической плотности, а не подсчета колониеобразующих единиц для количественной оценки ингибирования роста, экономит время и ресурсы.

Abstract

Традиционные методы проведения тестирования на чувствительность к противогрибковым препаратам для Candida albicans отнимают много времени и не дают количественных результатов. Например, общий подход основан на нанесении клеток, обработанных различными концентрациями противогрибковых молекул на агаровые пластины, а затем подсчете колоний для определения взаимосвязи между концентрацией молекул и ингибированием роста. Этот метод требует много табличек и значительного времени для подсчета колоний. Другой распространенный подход исключает планшеты и подсчет колоний путем визуального осмотра культур, обработанных противогрибковыми средствами, для определения минимальной концентрации, необходимой для подавления роста; Однако визуальный осмотр дает только качественные результаты, и информация о росте при субингибирующих концентрациях теряется. В этом протоколе описывается метод измерения чувствительности C. albicans к противогрибковым пептидам. Опираясь на оптические измерения плотности культур, метод сокращает время и материалы, необходимые для получения количественных результатов роста культур при различных концентрациях пептидов. Инкубацию гриба с пептидами проводят в 96-луночном планшете с использованием соответствующего буфера, при этом контрольные элементы представляют собой отсутствие ингибирования роста и полное ингибирование роста. После инкубации с пептидом полученные клеточные суспензии разбавляют для снижения активности пептидов, а затем выращивают в течение ночи. После ночного роста измеряется оптическая плотность каждой лунки и сравнивается с положительным и отрицательным контрольными элементами для расчета результирующего ингибирования роста при каждой концентрации пептида. Результаты с использованием этого анализа сопоставимы с результатами при использовании традиционного метода нанесения культур на агаровые пластины, но этот протокол сокращает пластиковые отходы и время, затрачиваемое на подсчет колоний. Хотя применение этого протокола было сосредоточено на противогрибковых пептидах, метод также будет применим для тестирования других молекул с известной или предполагаемой противогрибковой активностью.

Introduction

Candida albicans является членом микробиоты человека, которая колонизирует многочисленные места, включая полость рта, кожу, желудочно-кишечный тракт и влагалище¹. Для пациентов с ослабленным иммунитетом из-за таких заболеваний, как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и иммуносупрессивное лечение, колонизация C. albicans может привести к местному или системному кандидозу ^2,3. Использование доступных в настоящее время низкомолекулярных противогрибковых терапевтических средств, таких как амфотерицин В, азолы или эхинокандины, может быть осложнено проблемами растворимости и токсичности, а также резистентностью инфекций к терапевтическим средствам ^4,5. Из-за ограничений современных противогрибковых агентов исследователи постоянно ищут новые противогрибковые молекулы с активностью против C. albicans.

Антимикробные пептиды (АМП) являются потенциальной альтернативой существующим низкомолекулярным противогрибковым средствам ^6,7,8 и, как предполагается^, менее восприимчивы к развитию резистентности по сравнению с низкомолекулярными лекарственными средствами ⁹. АМФ представляют собой разнообразный набор пептидов, но они часто катионные, с широким спектром активности^10,11,12. AMP с активностью против C. albicans включают хорошо известные пептиды из семейств гистатинов и цекропинов 13,14,15, а также недавно описанные пептиды, такие как ToAP2, NDBP-5.7 и вариант гистатина 5 K11R-K17R^16,17. Из-за их потенциала для лечения инфекций Candida, выявление и разработка новых AMP, нацеленных на C. albicans, является важной целью для многих исследовательских групп.

В рамках процесса разработки эффективных AMP (и других противогрибковых агентов), нацеленных на C. albicans, тестирование in vitro обычно используется для выявления перспективных пептидов. Методы проверки противогрибковой активности против C. albicans обычно включают инкубацию клеток с последовательными разведениями AMP (в буфере или среде) в 96-луночных планшетах. Существует несколько методов оценки противогрибковой активности после инкубации. Метод, описанный Институтом клинических лабораторных стандартов, использует чисто визуальную оценку мутности лунок для определения минимальной концентрации (MIC) для полного ингибирования роста (по крайней мере, 50% ингибирование для отдельных противогрибковых агентов, таких как азолы и эхинокандины) и не обеспечивает количественной оценки роста при суб-МПК концентрациях¹⁸ . Другой широко используемый подход включает количественную оценку жизнеспособности после инкубации с АМП путем нанесения содержимого лунок на агаровые пластины, инкубации пластин и последующего подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на пластине. Этот метод был использован для оценки ряда пептидов, включая пептиды на основе гистатина 5, LL-37 и лактоферрин^{человека} 19,20,21. Этот метод требует относительно большого объема агара и большого количества тарелок и включает в себя утомительный подсчет КОЕ на тарелках. Чтобы получить больше количественных данных при меньшем количестве пластиковых отходов и избежать подсчета КОЕ, содержимое скважин можно использовать для инокуляции свежей среды в другой 96-луночный планшет. После инкубации вновь инокулированной пластины рост можно количественно определить путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) на считывателе абсорбционных пластин. Этот метод был использован для определения противогрибковой активности гистатина 5 и его фрагментов деградации и проникающих в клетки пептидов 17,22,23,24,25.

Этот протокол описывает, как проверить противогрибковую активность пептидов, и использует метод OD₆₀₀ для количественной оценки снижения жизнеспособности C. albicans из-за пептидов.

Protocol

Было получено одобрение от Университета Мэриленда, Колледж-Парк, Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) для работы с C. albicans в этом протоколе (PN 274). Штамм C. albicans SC5314 (см. Таблицу материалов) был использован в настоящем исследовании; Однако можно использовать и…

Representative Results

Использование измерений OD600 для количественной оценки снижения роста из-за противогрибковых пептидов значительно экономит время по сравнению с нанесением проб на покрытие и подсчетом КОЕ. Метод, описанный в этом протоколе, требует выполнения шагов в три разных дня. В первые сутк?…

Discussion

В данном протоколе описан эффективный подход к получению количественных данных о противогрибковой активности АМП в отношении грибкового патогена C. albicans. Одним из распространенных альтернативных подходов к тестированию пептидов и других противогрибковых агентов является микро?…

Materials

96-well plates (round bottom)	VWR	10062-902
Absorbance microplate reader	N/A	N/A	Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314	ATCC	MYA-2876	Other C. albicans may also be used
Hemocytometer	N/A	N/A	Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker	VWR	2620-926
Peptide(s)	N/A	N/A	Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors	VWR	18900-320	Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic	Fisher Scientific	BP332-500	For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	For making NaPB
UV spectrophotometer	N/A	N/A	Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder	BD Life Sciences	242820	May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose