Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra Candida albicans
Summary
Este protocolo descreve um método para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de peptídeos e outros compostos, como agentes antifúngicos de moléculas pequenas, contra Candida albicans. Seu uso de densidade óptica em vez de contar unidades formadoras de colônias para quantificar a inibição do crescimento economiza tempo e recursos.
Abstract
Os métodos tradicionais para a realização de testes de suscetibilidade antifúngica para Candida albicans são demorados e carecem de resultados quantitativos. Por exemplo, uma abordagem comum baseia-se no revestimento de células tratadas com diferentes concentrações de moléculas antifúngicas em placas de ágar e, em seguida, na contagem das colônias para determinar a relação entre a concentração da molécula e a inibição do crescimento. Este método requer muitas placas e tempo substancial para contar as colônias. Outra abordagem comum elimina as placas e a contagem de colônias, inspecionando visualmente as culturas tratadas com agentes antifúngicos para identificar a concentração mínima necessária para inibir o crescimento; no entanto, a inspeção visual produz apenas resultados qualitativos e as informações sobre o crescimento em concentrações subinibitórias são perdidas. Este protocolo descreve um método para medir a suscetibilidade de C. albicans a peptídeos antifúngicos. Baseando-se em medições ópticas de densidade de culturas, o método reduz o tempo e os materiais necessários para obter resultados quantitativos sobre o crescimento da cultura em diferentes concentrações de peptídeos. A incubação do fungo com peptídeos é realizada em uma placa de 96 poços usando um tampão apropriado, com controles representando nenhuma inibição de crescimento e inibição completa do crescimento. Após a incubação com o peptídeo, as suspensões celulares resultantes são diluídas para reduzir a atividade peptídica e, em seguida, cultivadas durante a noite. Após o crescimento noturno, a densidade óptica de cada poço é medida e comparada com os controles positivos e negativos para calcular a inibição de crescimento resultante em cada concentração de peptídeo. Os resultados usando este ensaio são comparáveis aos resultados usando o método tradicional de chapeamento das culturas em placas de ágar, mas este protocolo reduz o desperdício de plástico e o tempo gasto na contagem de colônias. Embora as aplicações deste protocolo tenham se concentrado em peptídeos antifúngicos, o método também será aplicável ao teste de outras moléculas com atividade antifúngica conhecida ou suspeita.
Introduction
Candida albicans é um membro da microbiota humana que coloniza vários locais, incluindo a cavidade oral, pele, trato gastrointestinal e vagina1. Para pacientes imunocomprometidos devido a doenças como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e tratamentos imunossupressores, a colonização de C. albicans pode levar à candidíase local ou sistêmica 2,3. O uso de terapias antifúngicas de moléculas pequenas atualmente disponíveis, como anfotericina B, azóis ou equinocandinas, pode ser complicado por problemas de solubilidade e toxicidade e pela resistência de infecções à terapêutica 4,5. Devido às limitações dos agentes antifúngicos atuais, os pesquisadores estão continuamente procurando novas moléculas antifúngicas com atividade contra C. albicans.
Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são uma alternativa potencial aos atuais agentes antifúngicos de moléculas pequenas 6,7,8 e são propostos como menos suscetíveis ao desenvolvimento de resistência em comparação com os fármacos de moléculas pequenas 9. Os AMPs são um conjunto diversificado de peptídeos, mas muitas vezes são catiônicos, com amplo espectro de atividade10,11,12. Os AMPs com atividade contra C. albicans incluem peptídeos bem conhecidos das famílias histatina e cecropina13,14,15, juntamente com peptídeos descritos mais recentemente como ToAP2, NDBP-5.7 e a variante de histatina 5 K11R-K17R 16,17. Devido ao seu potencial para o tratamento de infecções por Candida, identificar e projetar novos AMPs que visam C. albicans é um objetivo importante para muitos grupos de pesquisa.
Como parte do processo para desenvolver AMPs eficazes (e outros agentes antifúngicos) que visam C. albicans, testes in vitro são comumente usados para identificar peptídeos promissores. Métodos para testar a atividade antifúngica contra C. albicans geralmente envolvem a incubação de células com diluições seriadas dos AMPs (em tampão ou meio) em placas de 96 poços. Vários métodos estão disponíveis para avaliar a atividade antifúngica após a incubação. Uma técnica descrita pelo Clinical Laboratory Standards Institute utiliza uma avaliação puramente visual da turbidez dos poços para determinar a concentração mínima (CIM) para a inibição completa do crescimento (pelo menos 50% de inibição para agentes antifúngicos selecionados, como azóis e equinocandinas) e não fornece quantificação do crescimento em concentrações sub-CIM18 . Outra abordagem comumente usada envolve quantificar a viabilidade após a incubação com AMPs chapeando o conteúdo dos poços em placas de ágar, incubando as placas e, em seguida, contando o número de unidades formadoras de colônias (UFCs) na placa. Este método tem sido utilizado para avaliar uma série de peptídeos, incluindo peptídeos à base de histatina 5, LL-37 e lactoferrina humana 19,20,21. Esta técnica requer um volume relativamente grande de ágar e um alto número de placas e envolve a tediosa contagem de UFCs nas placas. Para obter mais dados quantitativos, gerando menos resíduos plásticos e evitando a contagem de UFCs, o conteúdo dos poços pode ser usado para inocular o meio fresco em outra placa de 96 poços. Após a incubação da placa recém-inoculada, o crescimento pode ser quantificado medindo a densidade óptica a 600 nm (OD600) em um leitor de placa de absorbância. Este método tem sido utilizado para determinar a atividade antifúngica da histatina 5 e seus fragmentos de degradação e peptídeos penetrantes celulares 17,22,23,24,25.
Este protocolo descreve como testar a atividade antifúngica de peptídeos e utiliza o método OD600 para quantificar a redução da viabilidade de C. albicans devido a peptídeos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma abordagem eficiente para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de AMPs contra o patógeno fúngico C. albicans. Uma abordagem alternativa comum para testar peptídeos e outros agentes antifúngicos é a microdiluição em caldo descrita no padrão M2718 do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), mas esse padrão se concentra na obtenção de resultados visuais qualitativos em vez de resultados quantitativos. Outra abordagem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R03DE029270, T32AI089621B), a National Science Foundation (CBET 1511718), o Departamento de Educação (GAANN-P200A180093) e um Subsídio de Sementes Cross-Campus da Universidade de Maryland.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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