Summary
Her beskriver vi en metode til bakteriel co-ekspression af differentielt mærkede proteiner ved hjælp af et sæt kompatible vektorer, efterfulgt af de konventionelle pulldown-teknikker til at studere proteinkomplekser, der ikke kan samles in vitro.
Abstract
Pulldown er et let og udbredt protein-protein interaktionsassay. Det har dog begrænsninger i at studere proteinkomplekser, der ikke samles effektivt in vitro. Sådanne komplekser kan kræve co-translationel samling og tilstedeværelsen af molekylære chaperoner; Enten danner de stabile oligomerer, som ikke kan adskille og re-associere in vitro eller er ustabile uden en bindende partner. For at overvinde disse problemer er det muligt at anvende en metode baseret på bakteriel co-ekspression af differentielt mærkede proteiner ved hjælp af et sæt kompatible vektorer efterfulgt af de konventionelle pulldown-teknikker. Arbejdsgangen er mere tidseffektiv sammenlignet med traditionel pulldown, fordi den mangler de tidskrævende trin med separat oprensning af interagerende proteiner og deres efterfølgende inkubation. En anden fordel er en højere reproducerbarhed på grund af et betydeligt mindre antal trin og en kortere periode, hvor proteiner, der findes i in vitro-miljøet , udsættes for proteolyse og oxidation. Metoden blev med succes anvendt til at studere en række protein-protein-interaktioner, når andre in vitro-teknikker viste sig at være uegnede. Metoden kan anvendes til batchtest af protein-protein-interaktioner. Repræsentative resultater er vist for undersøgelser af interaktioner mellem BTB-domæne og iboende uordnede proteiner og af heterodimerer af zinkfingerassocierede domæner.
Introduction
Konventionel pulldown bruges i vid udstrækning til at studere protein-proteininteraktioner1. Imidlertid interagerer oprensede proteiner ofte ikke effektivt in vitro2,3, og nogle af dem er uopløselige uden deres bindingspartner 4,5. Sådanne proteiner kan kræve co-translationel samling eller tilstedeværelse af molekylære chaperoner 5,6,7,8,9. En anden begrænsning ved konventionel pulldown er testning af mulig heteromultimeriseringsaktivitet mellem domæner, der kan eksistere som stabile homo-oligomerer samlet co-translationelt 8,10, da mange af dem ikke kan dissociere og re-associere in vitro i inkubationstiden. Samudtryk viste sig at være nyttigt til at overvinde sådanne problemer 3,11. Co-ekspression ved hjælp af kompatible vektorer i bakterier blev med succes anvendt til at rense store multi-subunit makromolekylære komplekser, herunder polycomb repressive complex PRC212, RNA polymerase II mediator head module13, bacteriophage T4 baseplate 14, SAGA complex deubiquitinylase module 15,16 og ferritin 17. Replikeringsoprindelser, der almindeligvis bruges til co-ekspression, er ColE1, p15A18, CloDF1319 og RSF20. I det kommercielt tilgængelige Duet-ekspressionssystem kombineres disse oprindelser med forskellige antibiotikaresistensgener og praktiske flere kloningssteder for at producere polycistroniske vektorer, hvilket tillader ekspression af op til otte proteiner. Disse oprindelser har forskellige kopinumre og kan anvendes i forskellige kombinationer for at opnå afbalancerede ekspressionsniveauer af målproteiner21. For at teste protein-proteininteraktioner anvendes forskellige affinitetsmærker; de mest almindelige er 6xhistidin, glutathion-S-transferase (GST) og maltosebindende protein (MBP), som hver især har en specifik affinitet til den tilsvarende harpiks. GST og MBP forbedrer også opløseligheden og stabiliteten af mærkede proteiner22.
Der er også udviklet en række metoder, der involverer proteinco-ekspression i eukaryote celler, hvoraf den mest fremtrædende er gær-to-hybrid-assay (Y2H)23. Y2H-analysen er billig, nem og tillader test af flere interaktioner; Imidlertid tager dens arbejdsgang mere end 1 uge at fuldføre. Der er også nogle få mindre hyppigt anvendte pattedyrcellebaserede assays, for eksempel fluorescerende to-hybrid assay (F2H)24 og cell array protein-protein interaction assay (CAPPIA)25. F2H-analysen er relativt hurtig, hvilket gør det muligt at observere proteininteraktioner i deres oprindelige cellulære miljø, men involverer brug af dyrt billeddannelsesudstyr. Alle disse metoder har en fordel i forhold til prokaryot ekspression, der giver det oprindelige eukaryote oversættelses- og foldemiljø; Imidlertid registrerer de interaktion indirekte, enten ved transkriptionel aktivering eller ved fluorescerende energioverførsel, som ofte producerer artefakter. Eukaryote celler kan også indeholde andre interaktionspartnere af proteiner af interesse, hvilket kan forstyrre testningen af binære interaktioner mellem proteiner af højere eukaryoter.
Denne undersøgelse beskriver en metode til bakteriel co-ekspression af differentielt mærkede proteiner efterfulgt af konventionelle pulldown-teknikker. Metoden gør det muligt at studere interaktioner mellem målproteiner, der kræver co-ekspression. Det er mere tidseffektivt sammenlignet med traditionel pulldown, hvilket tillader batchtest af flere mål, hvilket gør det fordelagtigt i de fleste tilfælde. Co-ekspression ved hjælp af kompatible vektorer er mere praktisk end polycistronisk co-ekspression, da det ikke kræver et besværligt kloningstrin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den skematiske gengivelse af metodearbejdsgangen er vist i figur 1.
1. Samtidig omdannelse af E. coli
- Forbered ekspressionsvektorer for målproteiner ved hjælp af standardkloningsmetoder.
BEMÆRK: Typisk er et godt udgangspunkt at bruge konventionelle pGEX/pMAL-vektorer med et ampicillingenresistensgen og ColE1-oprindelse til ekspression af GST/MBP-mærkede proteiner og en kompatibel vektor med p15A- eller RSF-oprindelse og kanamycinresistens til at udtrykke 6xHis-mærkede proteiner, i nogle tilfælde kombineret med enten Thioredoxin eller SUMO-tag for at øge opløseligheden. Normalt skal flere kombinationer af tags testes inden eksperimentet. Den beskrevne metode i sig selv er praktisk til batchtest af ekspressionsbetingelserne for målproteiner. Det er vigtigt at bemærke, at de fleste Rosetta-stammer allerede indeholder plasmidet med p15A-oprindelse til ekspression af tRNA'erne for sjældne codon;, så hvis anvendelse af sådanne stammer er en mulig mulighed, bør p15A-plasmiderne undgås. Se materialefortegnelsen for detaljer.- Der dyrkes bakterier af en passende stamme i Luria-Bertani (LB) medier ved 37 °C til en optisk densitet (OD) på 0,1-0,2. BL21 (DE3) stamme blev brugt til eksempler i denne undersøgelse.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge frisklavede kompetente celler for at opnå effektiv co-transformation med to vektorer. Hvis mere end to vektorer skal transformeres sammen, er det bedre at transformere dem sekventielt for at opnå god transformationseffektivitet. Elektroporation er et godt alternativ. - Der centrifugeres 1,0 ml bakteriesuspension i 1 min ved 9.000 x g ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 0,5 ml iskold buffertransformationsbuffer (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl2 og 15 mMCaCl2) og inkuberes i 10 minutter på is.
- Der centrifugeres i 30 s ved 8.000 x g ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 100 μL TB-buffer, tilsættes 100 ng af hver vektor, og der inkuberes i 30 minutter på is. Transformér enkeltvektorer separat for at studere proteinadfærd uden co-ekspression. Derudover skal du co-transformere udtryksvektorer parvis med tomme co-ekspressionsvektorer til ikke-specifikke bindingskontroller.
BEMÆRK: I eksemplerne i denne undersøgelse blev pGEX/pMAL-vektorer med tilsvarende cDNA'er fusioneret til GST/MBP cDNA'er anvendt i kombination med kompatible pACYC-afledte vektorer med cDNA-kodende partnerproteindomæner fusioneret med thioredoxin cDNA. - Der opvarmes ved 42 °C i 150 sekunder, hvorefter det afkøles i 1 minut på is.
- Der tilsættes 1 ml flydende LB-substrat uden antibiotika og inkuberes ved 37 °C i 90 minutter. Plade på LB-agarplader indeholdende 0,5% glucose og tilsvarende antibiotika (almindelige koncentrationer er: 50 mg / L ampicillin; 20 mg / L kanamycin; 50 mg / L streptomycin; 35 mg / L chloramphenicol). Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
- Der dyrkes bakterier af en passende stamme i Luria-Bertani (LB) medier ved 37 °C til en optisk densitet (OD) på 0,1-0,2. BL21 (DE3) stamme blev brugt til eksempler i denne undersøgelse.
2. Udtryk
- Skyl cellerne fra pladen med 2 ml flydende LB-medier til 50 ml LB-medier med tilsvarende antibiotika (almindelige koncentrationer er: 50 mg / L ampicillin; 20 mg / L kanamycin; 50 mg / L streptomycin; 35 mg / L chloramphenicol). Tilføj metalioner eller andre kendte co-faktorer (i eksemplerne i denne undersøgelse blev 0,2 mM ZnCl2 tilføjet til medierne). En prøve med 20% glycerol opbevares ved -70 °C med henblik på en efterfølgende gentagelse af forsøget.
BEMÆRK: Det anbefales at skylle flere kolonier direkte fra pladen for at udelukke muligheden for dårlig ekspression i en enkelt isoleret klon på grund af lejlighedsvise rekombinationshændelser mellem to plasmider. - Cellerne dyrkes med en konstant rotation på 220 rpm ved 37 °C til en OD på 0,5-0,7, afkøles til stuetemperatur (RT), og der tilsættes isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til 1 mM. Der opbevares en 20 μL delprøve cellesuspension som kontrol af den ikke-inducerede prøve.
- Cellerne inkuberes med en konstant rotation på 220 o/min ved 18 °C natten over.
BEMÆRK: Den optimale tid og temperatur for inkubation kan variere; 18 °C natten over fungerer bedst for de fleste proteiner og anbefales at blive prøvet som standard. Reducer inkubationstiden til 2-3 timer, hvis der observeres en stærk ikke-specifik binding. - Del bakteriesuspensionen i to dele (eller flere, hvis der blev brugt mere end to forskellige mærker) og opbevar en 20 μL alikvote af cellesuspensionen for at bekræfte proteinekspression. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 15 min.
BEMÆRK: Pausepunkt: bakteriepiller kan opbevares ved -70 °C i mindst 6 måneder.
3. Pulldown-analyse
BEMÆRK: De detaljerede procedurer er beskrevet for proteiner mærket med enten 6xHis eller MBP/GST. Alle procedurer udføres ved 4 °C.
- Resuspender bakteriepillerne i 1 ml iskold lysisbuffer med proteasehæmmere og reduktionsmidler (se nedenfor) tilsat umiddelbart før forsøget. Undgå dithiotreitol (DTT), når du bruger metalchelaterende harpikser, da det fjerner metalioner. Juster buffersammensætningen for de testede proteiner. De almindelige opskrifter af lysisbuffere, der findes egnede til de fleste proteiner, er:
- 6xHis-pulldown: Bland 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM beta-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsfulfonylfluorid (PMSF) og en 1:1.000 fortynding af proteasehæmmercocktailen (se materialetabel).
- GST- eller MBP-pulldown: Bland 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF og en 1:1.000 fortynding af proteasehæmmercocktailen (se materialetabel).
- Forstyrre cellerne ved sonikering på is. Opbevar en 20 μl alikvote til elektroforese.
BEMÆRK: Der kræves typisk 20-25 impulser på 5 s med 15 s intervaller med 20 W udgangseffekt pr. prøve. Den passende sonikeringseffekt bør justeres for hvert instrument for at undgå overophedning og sikre total celleforstyrrelse. For at opnå bedre ydeevne anbefales det kraftigt at bruge high-throughput multi-tip sonicator sonder. - Centrifuger ved 20.000 x g i 30 min. Der indsamles 20 μL af det klarede lysat til efterfølgende SDS-PAGE-analyse.
- Harpiksen (50 μL for hver prøve) afbalanceres med 1 ml iskold lysisbuffer i 10 minutter, centrifugeres ved 2.000 x g i 30 s, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes cellelysater (total proteinkoncentration: 20-50 mg/ml) til harpiksen, inkuberes i 10 minutter ved en konstant rotation på 15 omdr./min., centrifugeres ved 2.000 x g i 30 s, og supernatanten kasseres. Der indsamles 20 μL af den ubundne fraktion til efterfølgende SDS-PAGE-analyse.
- Tilsæt 1 ml iskold vaskebuffer og inkuber i 1 min. Der centrifugeres ved 2.000 x g i 30 s., og supernatanten kasseres. De almindelige opskrifter på vaskebuffere er:
- 6xHis-pulldown: Bland 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol og 5 mM beta-mercaptoethanol.
- GST- eller MBP-pulldown: Bland 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol og 5 mM DTT.
- Der udføres to lange vaske: Der tilsættes 1 ml buffer til iskold vask, inkuberes i 10-30 minutter med en konstant rotation på 15 omdr./min., der centrifugeres ved 2.000 x g i 30 s., og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 1 ml buffer til iskold vask, inkuberes i 1 min., centrifugeres ved 2.000 x g i 30 s, og supernatanten kasseres.
- De bundne proteiner elueres med 50 μL elueringsbuffer i en ryster ved 1.200 o/min i 10 min. De almindelige opskrifter på elueringsbuffere er:
- 6xHis-pulldown: Bland 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol og 5 mM beta-mercaptoethanol.
- GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM glutathion (justeret til pH 7,5 med basisk Tris) og 5 mM DTT.
- MBP-pulldown: Bland 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltose og 5 mM DTT.
- Analyser de eluerede proteiner med SDS-PAGE.
BEMÆRK: Procentdelen af acrylamid bør tilpasses proteinernes størrelse. I eksemplerne i denne undersøgelse blev der anvendt 12% acrylamidgeler, der kørte i tris-glycin-SDS-buffer (2 mM Tris, 250 mM glycin, 0,1% SDS) ved konstant spænding på 180 V. Geler blev farvet ved kogning i 0,2% Coomassieblå R250, 10% eddikesyre og 30% isopropanol og affarvet ved kogning i 10% eddikesyre. Mængden af belastet protein bør ikke være ens, da forskellige mængder interagerende proteiner kan trækkes ned i forskellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metode blev rutinemæssigt brugt med mange forskellige mål. Her præsenteres nogle repræsentative resultater, som sandsynligvis ikke kan opnås ved hjælp af konventionelle pulldown-teknikker. Den første er undersøgelsen af specifik ZAD (zink-finger-associeret domæne) dimerisering11. ZAD'er danner stabile og specifikke dimerer, hvor heterodimerer kun er mulige mellem nært beslægtede domæner inden for paraloge grupper. Dimererne dannet af disse domæner er stabile og dissocieres ikke i mindst et par dage; blanding af rensede ZAD'er giver således ingen påviselig binding. Samtidig viser co-ekspressionen af MBP og Thioredoxin-6xHis-fusionerede ZAD'er god og reproducerbar homo-dimeriseringsaktivitet (figur 2A), der vises som et ekstra bånd i SDS-PAGE-resultaterne af MBP-pulldown-assayet. En lille del af heterodimerer kan ses med M1BP co-udtrykt med et andet domæne; denne interaktion blev ikke bekræftet med Y2A og er sandsynligvis et resultat af ikke-specifik association på grund af høj proteinkoncentration, da disse domæner er cysteinrige og ekstremt aggregeringstilbøjelige. Især i dette tilfælde er 6xHis-pulldown upassende, da ZAD'er er metalkoordinerende domæner, der ikke specifikt binder til den metalchelaterende harpiks. En sådan aktivitet bør undersøges omhyggeligt i et parallelt eksperiment.
Et andet eksempel er konkurrenceanalysen mellem ENY2-proteinet og dets bindingspartnere Sgf11 (1-83aa) og zinkfingerdomænet (460-631 aa) af CTCF-proteinet26. Når det udtrykkes alene, danner ENY2-proteinet dimerer, der forhindrer det i at interagere med sine oprindelige bindingspartnere. Formentlig binder både Sgf11- og CTCF-proteinerne til den samme molekylære overflade af ENY2, hvilket gør deres interaktion gensidigt udelukkende. I co-ekspressionsanalysen interagerede 6xHis-tagget ENY2 både med GST-mærket Sgf11 og MBP-CTCF, men der var ingen GST-Sgf11 til stede i MBP-pulldowns og omvendt (figur 2B). Disse resultater tyder på, at der ikke kan dannes noget tredobbelt kompleks, og interaktioner udelukker hinanden. Disse data blev uafhængigt bekræftet med andre assays og understøtter ENY2's forskellige funktionelle roller i disse komplekser. Der skal gøres opmærksom på, at store affinitetsmærker i sig selv kan pålægge steriske hindringer og forhindre kompleks dannelse; Konklusionen bør derfor ikke udelukkende baseres på samekspressionsdata.
En trinvis sammenligning af arbejdsgange for konventionelle og koblede co-expression pulldowns er vist i figur 3A. Co-expression koblet pulldown er mindst to gange mere tidseffektiv, selv med et lille antal prøver, og giver god skalerbarhed. Resultaterne af at bruge begge teknikker til at studere den samme interaktion mellem BTB-domænet for CP190-proteinet (1-126aa) og det GST-mærkede C-terminaldomæne (610-818aa) for Drosophila CTCF-protein (dCTCF) er vist i figur 3B. Begge metoder viser god effektivitet og reproducerbarhed (assays blev udført i tre replikater); i dette tilfælde viste co-ekspression koblet pulldown lavere ikke-specifik binding, som det kan ses i kontrolprøverne med GST-protein alene.
Figur 1: Den skematiske gengivelse af protokollen. Skemaet viser den metodearbejdsgang, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater . (A) Undersøgelse af zinkfingerassocieret domæne (ZAD) homodimerisering i MBP- og 6xHis-pulldown-assays. ZAD'er fusioneret enten med MBP (40 kDa) eller med 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) blev co-udtrykt i bakterieceller og affinitet oprenset med amyloseharpiks (binder MBP-mærkede proteiner) eller med Ni-NTA-harpiks (binder 6xHis-mærkede proteiner). Co-oprensede proteiner blev visualiseret med SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie-farvning. MBP-pulldown-resultater vises i øvre paneler, 6xHis-pulldown-resultater er i nedre paneler (bruges kun som proteinekspressionskontrol, da mange ZAD'er binder ikke-specifikt til Ni-NTA). B) Undersøgelse af interaktioner, der gensidigt udelukker hinanden, mellem ENY2- og Sgf11/CTCF-proteiner. GST-mærkede Sgf11 (1-81aa), MBP-mærkede CTCF-zinkfingerdomæne (460-631aa) og 6xHis-mærkede ENY2-proteiner blev co-udtrykt i forskellige kombinationer og affinitet renset med amyloseharpiks, glutathionharpiks (binder GST-mærkede proteiner) eller med Ni-NTA-harpiks. Co-oprensede proteiner blev visualiseret med SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie-farvning. Figuren i panelerne A og B er ændret med tilladelse fra Bonchuk et al.11 og Bonchuk et al.26. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af arbejdsgange for konventionelle og koblede co-expression pulldown-assays. (A) Trinvis sammenligning af krævede tidsintervaller i arbejdsgangen for det konventionelle pulldown-assay sammenlignet med pulldown koblet til co-expression. (B) Sammenligning af to forskellige pulldown-teknikker til undersøgelse af interaktionen mellem dCTCF C-terminaldomænet (610-818aa) og BTB-domænet for CP190-proteinet (1-126aa) i GST-pulldown-assays. dCTCF (610-818aa) fusioneret med GST (25kDa) eller GST alene blev enten co-udtrykt i bakterieceller eller inkuberet in vitro med Thioredoxin-6xHis-mærket CP190 BTB og affinitet renset med glutathionharpiks. Tre uafhængige replikater af hvert assay vises. Co-oprensede proteiner blev visualiseret med SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie-farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metode tillader test af protein-proteininteraktioner, der ikke effektivt kan samles in vitro og kræver co-ekspression. Metoden er en af de få egnede metoder til undersøgelse af heterodimeriserende proteiner, som også er i stand til homodimerisering, da sådanne proteiner, når de renses separat, danner stabile homodimerer, som oftest ikke kan dissocieres og associeres igen under eksperimentet 3,11.
Arbejdsgangen for den beskrevne metode er mere tidseffektiv sammenlignet med traditionel pulldown, fordi den mangler de tidskrævende trin med separat oprensning af interagerende proteiner og deres efterfølgende inkubation. En anden fordel er en højere reproducerbarhed på grund af et betydeligt mindre antal trin og en kortere periode, hvor proteiner findes i et kunstigt in vitro-miljø, mens de udsættes for proteolyse og oxidation. Metoden blev med succes anvendt til at studere flere protein-protein-interaktioner, når andre in vitro-teknikker viste sig at være uegnede 3,11,27. Parallel udfældning med forskellige affinitetsmærker giver kontrol over proteinekspressionsniveauet. Da metoden er lettere og hurtigere end konventionel pulldown, kan den bruges i stedet for den, selvom co-ekspression ikke er absolut påkrævet. Hastigheden af celleforstyrrelser er en ikke-indlysende flaskehals, som kan øge den samlede tid betydeligt og kan føre til en afvigelse i resultaterne på grund af den forskellige tid mellem den første og sidste prøve, der udsættes for in vitro-tilstande og proteolyse. Således anbefales det kraftigt at bruge multi-tip sonikatorsonder med høj kapacitet; se eksempler på materialetabellen.
Brug af magnetiske perler kan reducere den ikke-specifikke binding og yderligere fremskynde metoden, hvilket reducerer den tid, der kræves til vasketrin. Brug af vektorer med kompatibel oprindelse har en fordel i forhold til polycistronisk ekspression, da de giver en bekvem kombinatorisk tilgang til at teste flere proteininteraktioner med det samme mål og ikke kræver produktion af en ny vektor for hver kombination.
En ulempe ved metoden er den relativt høje sandsynlighed for falsk-positive resultater, da proteiner udtrykkes i bakterier ved høje koncentrationer. Således bør uventede interaktioner opdaget ved denne metode behandles med forsigtighed og testes med et uafhængigt assay, såsom Y2A eller cellulære teknikker24, som også bruger co-ekspression 3,11,28. Bioinformatiske tilgange med høj kapacitet kan også bruges til at analysere og validere komplekse protein-protein-interaktionsnetværk29. En anden ejendommelig hindring er, at proteinkomplekser kan have helt forskellige biokemiske egenskaber sammenlignet med separate proteiner; Komplekset kan være uopløseligt, mens dets komponenter er til stede i opløsningen. Dette problem kan typisk løses ved at fusionere proteinerne til det passende opløselighedsmærke. MBP er den mest effektive, mens NusA er et andet godt allround alternativ22. GST-tag viste sig at være effektivt med mange zinkkoordinerende domæner, men da det er dimerisk, bør det undgås, når man arbejder med oligomere domæner. Tværtimod fungerer små monomere domæner som Thioredoxin og SUMO godt med multimere proteindomæner.
Kritiske trin i den beskrevne metode er den korrekte tid for proteinekspression (en kortere tid er påkrævet, hvis ikke-specifik binding observeres, mens længere inkubationstider kan være nødvendige for at forbedre dårlig proteinekspression), hurtig celleforstyrrelse, korrekt valg af buffere og opretholdelse af den konstante temperatur under protokollen. Overdreven inkubationstid efter induktion kan resultere i proteinaggregering i bakterier, hvilket fører til falske positive resultater. På den anden side kræver nogle proteiner mere tid til at blive udtrykt i tilstrækkelige mængder. Temperaturudsving under sonikering og vask trin kan føre til ændringer i buffer pH og protein udfældning. Forkert buffervalg kan også resultere i ikke-specifik proteinaggregering.
I tilfælde af dårlig proteinekspression bør forskellige opløselighedsmærker forsøges samt en øget inkubationstid efter induktion. Hvis der observeres en stærk ikke-specifik tilknytning, skal alle nødvendige negative kontroller køres for at bestemme den mulige ikke-specifikke tilknytning af proteiner med harpiks eller affinitetsmærket. Hvis kontrollerne ikke virker, skal forskellige kombinationer af affinitetsmærker forsøges, og der skal anvendes forskellige buffere. Mange proteiner har tendens til ikke-specifikt at binde til de metalchelaterende harpikslignende ZAD'er, der er nævnt i denne artikel; i sådanne tilfælde ville MBP/GST-pulldown generelt være tilstrækkeligt uden et gensidigt eksperiment, der kun kan bruges til proteinekspressionskontrol. Hvis negative kontroller fungerer godt, bør proteinekspressionstiden reduceres, og buffersystemet og reduktionsmidlet ændres, eller koncentrationen af reduktionsmidlet øges, især når der arbejdes med cysteinrige proteiner. I tilfælde af dårlig reproducerbarhed af resultater skal man være opmærksom på celleforstyrrelsestrinnet, som skal udføres hurtigt, men uden overophedning. Temperaturen bør overvåges under hele forsøget.
Denne metode kan let ændres til at studere multiproteinkomplekser eller ribonukleoproteiner. En anden mulig anvendelse er batchtest af proteinkompleks ekspression og oprensningsbetingelser til efterfølgende undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Russian Science Foundation-projekterne 19-74-30026 (metodeudvikling og validering) og 19-74-10099 (protein-protein-interaktionsassays); og af Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse-tilskud 075-15-2019-1661 (analyse af repræsentative protein-proteininteraktioner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S.
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G.
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al.
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
