Detectie van abnormaal prioneiwit door immunohistochemie

Summary

Immunolabeling van abnormaal prioneiwit met behulp van immunohistochemieprotocollen vereist specifieke monster- en anti-PrP-antilichaamvoorbereidingsmethoden. Het huidige protocol beschrijft de belangrijkste stappen in epitoopontmaskering om te zorgen voor een goede PrP-immunolabeling en om niet-specifieke achtergrondkleuring te minimaliseren. Ook houdt deze benadering rekening met bioveiligheidsmaatregelen bij het uitvoeren van immunohistochemische studies met de prion-geïnfecteerde weefsels.

Abstract

Abnormale prioneiwitten (PrP^Sc) zijn de ziekte-geassocieerde isovorm van cellulair prioneiwit en diagnostische markers van overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE’s). Deze neurodegeneratieve ziekten treffen mensen en verschillende diersoorten en omvatten scrapie, zoönotische boviene spongiforme encefalopathie (BSE), chronische verspillingsziekte van hertachtigen (CWD) en de nieuw geïdentificeerde kameel prionziekte (CPD). De diagnose van TSE’s is gebaseerd op immunodetectie van PrP^Sc door toepassing van zowel immunohistochemie (IHC) als westerse immunoblotmethoden (WB) op encefalonweefsels, namelijk de hersenstam (obex-niveau). IHC is een veelgebruikte methode die primaire antilichamen (monoklonaal of polyklonaal) gebruikt tegen antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. De antilichaam-antigeenbinding kan worden gevisualiseerd door een kleurreactie die gelokaliseerd blijft in het gebied van het weefsel of de cel waar het antilichaam op gericht was. Als zodanig worden bij prionziekten, net als in andere onderzoeksgebieden, de immunohistochemische technieken niet alleen gebruikt voor diagnostische doeleinden, maar ook in pathogenesestudies. Dergelijke studies omvatten het detecteren van de PrP^Sc-patronen en -typen van de eerder beschreven patronen om de nieuwe prionstammen te identificeren. Aangezien BSE mensen kan infecteren, wordt aanbevolen dat faciliteiten en/of praktijken van bioveiligheidslaboratoria niveau 3 (BSL-3) worden gebruikt voor het hanteren van monsters van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen die in de TSE-bewaking zijn opgenomen. Daarnaast worden containment en prion-dedicated apparatuur aanbevolen, waar mogelijk, om verontreiniging te beperken. De PrP^Sc IHC-procedure bestaat uit een mierenzuur epitoop-deasking stap die ook fungeert als een prion-inactivatiemaatregel, omdat formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels die in deze techniek worden gebruikt, besmettelijk blijven. Bij het interpreteren van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat niet-specifieke immunolabeling wordt onderscheiden van doeletikettering. Voor dit doel is het belangrijk om artefacten van immunolabeling te herkennen die zijn verkregen in bekende TSE-negatieve controledieren om die te onderscheiden van specifieke PrP Sc-immunolabelingtypen, die kunnen variëren tussen TSE-stammen, gastheersoorten en prnp-genotype, verder hierin beschreven.

Introduction

Volgens de prionhypothese is de abnormale isovorm (PrP^Sc) de primaire of enige component van het infectieuze agens in overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE’s). Bevestiging voor de diagnose van TSE is gebaseerd op immunodetectie van PrP^Sc door toepassing van immunohistochemie (IHC) protocollen en/of westerse immunoblotmethoden (WB) van encefalonweefsels¹.

IHC is een methode waarbij monoklonale of, in sommige gevallen, polyklonale antilichamen (als primaire antilichamen) worden gebruikt als eerste stap in immunostaining van specifiek gerichte antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. Elke effectieve primaire antilichaam-antigeenbinding wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichamen. Deze secundaire antilichamen worden geconjugeerd aan enzymen, zoals mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP). Visualisatie wordt vervolgens bereikt door een substraat aan deze enzymen toe te voegen, waardoor onoplosbare kleurproducten worden geproduceerd die zijn gelokaliseerd in gebieden waar de primaire antilichamen zijn gebonden aan de beoogde antigenen. Verbeterde visualisatie kan worden bereikt door counterstaining, waarbij een kleurstof wordt gebruikt om een contrast te creëren tussen immunogelabeld en niet-immunogelabeld weefsel².

Met IHC met behulp van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefsels (FFPE), kan formalinefixatie de effectiviteit van primaire antilichamen tenietdoen als gevolg van cross-linking door formaldehyde en verwarming en uitdroging tijdens paraffine-inbedding. Deze veranderen de conformatie van eiwitten, vernietigen, denatureren of maskeren de epitopen, waardoor hun detectie wordt verminderd of ingetrokken³. Als zodanig vereist dit antigeen retrieval (AR). De AR-technieken verstoren formaldehyde-gerelateerde chemische groep cross-linking in de antigene moleculen, waardoor de oorspronkelijke antigeen-eiwitconformatie wordt hersteld of ontmaskerd. Dit resulteert in het herstellen van de antilichaam-antigeen (epitoop) affiniteit voor immunolabeling. De uiteindelijke werkzaamheid van AR hangt af van de kwaliteiten van het beoogde antigeen en/of het primaire antilichaam².

Heat-induced antigen (epitope) retrieval (HIER) is een procedure van AR³ en wordt routinematig gebruikt voor PrP^Sc IHC-detectie, zoals hierin beschreven. IHC is essentieel voor de diagnose en wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria om de weefselverdeling van een pathologie-geassocieerd antigeen te bepalen. Het wordt veel gebruikt bij het diagnosticeren en onderzoeken van kanker, neurowetenschappen en infectieziekten⁴, onder anderen. Voor TSE’s speelt IHC een belangrijke rol in diagnose en onderzoek voor het bevestigen en onderzoeken van PrP^{Sc-distributie} in natuurlijke gastheren en experimentele modellen. IHC draagt bij aan prionpathogenesestudies en de analyse van PrP Sc-depositietypen en -patronen, namelijk in neurale weefsels⁵, om afwijkingen van routinematig beschreven infecties te detecteren en vermeende nieuwe prionstammen te identificeren.

Omdat prionen van boviene spongiforme encefalopathie (BSE) de mens kunnen infecteren, kunnen bepaalde laboratoriumprotocollen die betrokken zijn bij het werk met BSE het gebruik van BSL-3-faciliteiten en -praktijken vereisen⁶. Deze omvatten het gebruik van een verzegelde secundaire container om potentiële met BSE geïnfecteerde weefselmonsters binnen het instituut en het laboratorium te vervoeren. Het omvat ook het aanwijzen van inperkingsgebieden en prionspecifieke apparatuur voor BSE-onderzoek en -analyse, waar mogelijk. Dit wordt gedaan om besmetting buiten het werkgebied te voorkomen en een besloten ruimte te bieden, omdat decontaminatieprocedures noodzakelijk worden.

Dienovereenkomstig volgt het Laboratorium voor Pathologie van INIAV de aanbevolen bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) faciliteiten en praktijken⁶ om potentiële prion-geïnfecteerde monsters van weefsels van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen in verband met de TSE-surveillance te beheren.

Formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels opgenomen in TSE diagnostische of onderzoeksprocedures, vooral in het centrale zenuwstelsel, kunnen potentieel besmettelijk zijn. Daarom moeten deze vaste weefsels worden behandeld met mierenzuur om de infectiviteit van prionen, indien aanwezig, voorafgaand aan weefselverwerking te verminderen. Dit wordt uitgevoerd door vaste, bijgesneden weefsels (ongeveer 2-4 mm dikte) in een verwerkingscassette te plaatsen. De cassette wordt vervolgens ondergedompeld in 98% mierenzuur (gedurende 1 uur). Na onderdompeling worden de cassettes met weefsels gedurende 30 minuten in stromend leidingwater gewassen en teruggebracht naar het fixatief voor verdere verwerking. Als weefselsecties niet vóór de verwerking worden behandeld, moeten postmicrotomische weefselsecties gedurende ten minste 5 minuten vóór histologische kleuring in onverdund mierenzuur worden ondergedompeld⁷. Het IHC-protocol voor PrP^Sc bevat een routinematige mierenzuur-epitoop-ontmaskeringsstap, die ook dient om prionen⁷ te inactiveren. Na deze prioninactiveringsstappen kunnen de resulterende vaste weefsels vervolgens worden verwerkt bij BSL-2 met behulp van standaard BSL-2-praktijken.

De minimale weefselbemonsteringsvereiste voor TSE-diagnose bij elk dier dat onder TSE-surveillance valt, is het verzamelen van de hersenstam (op obex-niveau). Bovendien wordt voor het opsporen van atypische BSE en scrapie geadviseerd om ook een deel van het cerebellum te verzamelen ^1,8. Voor CWD-diagnose moeten zowel hersenstam (obex) als retrofaryngeale lymfeklieren worden getest, omdat PrP Sc kan worden gedetecteerd in lymfoïde weefsels zonder detecteerbare PrP^Sc in obex⁹, beoordeeld door Machado et ^al.10.

Het obex-gedeelte van de hersenstam omvat diagnostische TSE-doellocaties, namelijk de dorsale vagale kern (DVN), solitaire tractuskern (STN) en spinale tractuskern van de trigeminuszenuw (V). Deze gebieden vertonen consequent bilaterale PrP Sc-accumulatie, zelfs in de vroege stadia van BSE en klassieke scrapie. In klinische gevallen van gevorderde TSE vertonen alle grijze stofgebieden in de hersenstam een wijdverspreide PrP^{Sc-distributie 11}.

Voordat de hersenmonsters worden gesegmenteerd en verwerkt, worden ze geëvalueerd (figuur 1) om het niveau van autolyse en de aanwezigheid van weefselschade vast te stellen die mogelijk de geschiktheid van het monster voor IHC-gebaseerde bevestigende diagnose⁸ in gevaar brengt. Om de integriteit van de voorbereidende protocollen en de analyseresultaten te valideren, worden de positieve en negatieve weefselmonsters van TSE opgenomen als controles in combinatie met de bereiding van weefsels uit testgevallen in elke test.

Figuur 1: De PrP^Sc IHC procedure. Representatie van de stapsgewijze volgorde van de PrP^Sc IHC-procedure van deparaffinisatie van weefselsecties tot uiteindelijke immunostaining en detectie (FFPE – Formaline-fixed paraffine-embedded; Mab – monoklonaal antilichaam; DAB – 3,3′ diaminobenzidine). Deze figuur is gemaakt in BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

De hierin beschreven IHC-procedure is een onderdeel van het onderzoeksproject FAIRJ-CT98-7021, “De oprichting van een Europees netwerk voor de surveillance van TSE’s van herkauwers en de standaardisatie en harmonisatie van het proces en de criteria voor de identificatie van verdachte gevallen”. Het volgt de diagnostische criteria die zijn gedefinieerd door de Wereldorganisatie voor diergezondheid, WOAH (voorheen het Office International des Épizooties, OIE)1 en het Europees referentielaboratorium…

Representative Results

Aangezien niet-specifieke doelimmunolabeling mogelijk is, is het belangrijk om het niveau van niet-specifieke immunolabeling bij bekende TSE-negatieve controledieren vast te stellen. Dit is een belangrijke stap om specifieke PrPSc immunolabeling7 goed te interpreteren (figuur 2). Non-target labeling door anti-PrP-antilichamen is waargenomen als discrete intraneuronale fijnstofkleuring (duidelijker in de hypoglossale kern en accessoire cuneaatkern)…

Discussion

TSE’s zijn potentiële zoönotische ziekten. Na het opduiken van BSE in 1986 in het Verenigd Koninkrijk werd Portugal een van de lidstaten van de Europese Unie met een hogere incidentie van deze ziekte^14,15. Om deze ziekte onder controle te houden, zijn andere TSE’s die zijn opgedoken (klassieke en atypische scrapie, BSE-varianten en momenteel de bewaking van chronische verspillingsziekte bij hertachtigen), bewakingsmechanismen ontwikkeld door het directoraat-gen…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted