Summary

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Published: May 05, 2023
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Summary

A imunomarcação de proteínas priônicas anormais usando protocolos de imunohistoquímica requer amostras específicas e metodologias de preparação de anticorpos anti-PrP. O presente protocolo descreve os principais passos na remoção de epítopos para garantir a imunomarcação adequada de PrP e minimizar a coloração de fundo inespecífica. Além disso, essa abordagem considera medidas de biossegurança ao realizar estudos imunohistoquímicos com os tecidos infectados por príons.

Abstract

As proteínas priônicas anormais (PrPSc) são a isoforma associada à doença da proteína priônica celular e marcadores diagnósticos de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). Estas doenças neurodegenerativas afectam os seres humanos e várias espécies animais e incluem o tremor epizoótico, a encefalopatia espongiforme bovina zoonótica (EEB), a doença crónica dos cervídeos (CWD) e a recém-identificada doença do prião dos camelos (DPC). O diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção dePrP Sc pela aplicação dos métodos de imunohistoquímica (IHQ) e imunoblot ocidental (WB) em tecidos encéfalos, ou seja, o tronco cerebral (nível obex). A imunoistoquímica é um método amplamente utilizado que utiliza anticorpos primários (monoclonais ou policlonais) contra antígenos de interesse em células de um corte tecidual. A ligação anticorpo-antígeno pode ser visualizada por uma reação de cor que permanece localizada na área do tecido ou célula onde o anticorpo foi alvo. Assim, nas doenças priônicas, como em outros campos de pesquisa, as técnicas de imuno-histoquímica não são utilizadas apenas para fins diagnósticos, mas também em estudos de patogênese. Tais estudos envolvem a detecção dos padrões e tipos dePrP Sc a partir daqueles descritos anteriormente para identificar as novas cepas de príons. Uma vez que a EEB pode infectar seres humanos, recomenda-se que sejam utilizadas instalações e/ou práticas de laboratório de biossegurança nível 3 (BSL-3) para manusear bovinos, pequenos ruminantes e amostras de cervídeos incluídas na vigilância das EET. Além disso, recomendam-se, sempre que possível, equipamentos de contenção e dedicados a príons para limitar a contaminação. O procedimento de IHQPrP Sc consiste em uma etapa de desmascaramento de epítopos de ácido fórmico também atuando como uma medida de inativação do príon, uma vez que os tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina usados nesta técnica permanecem infecciosos. Ao interpretar os resultados, deve-se ter cuidado para distinguir a imunomarcação não específica da rotulação alvo. Para esse propósito, é importante reconhecer artefatos de imunomarcação obtidos em animais controles conhecidos negativos para EET para diferenciá-los de tipos específicos de imunomarcaçãoPrP Sc , que podem variar entre cepas de EET, espécie hospedeira e genótipo prnp , descritos mais detalhadamente neste artigo.

Introduction

De acordo com a hipótese do príon, a isoforma anormal (PrP Sc) é o componente primário, ou único, do agente infeccioso nas encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). A confirmação para o diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção dePrP Sc por meio da aplicação de protocolos de imunohistoquímica (IHQ) e/ou métodos de immunoblot ocidental (WB) de tecidos encéfalos1.

A imunoistoquímica é um método que emprega anticorpos monoclonais ou, em alguns casos, policlonais (como anticorpos primários) como primeiro passo na imunomarcação de antígenos especificamente direcionados de interesse localizados em células de um corte tecidual. Qualquer ligação anticorpo-antígeno primário eficaz é então visualizada usando anticorpos secundários específicos para os anticorpos primários. Esses anticorpos secundários são conjugados a enzimas, como a peroxidase de raiz forte (HRP) ou a fosfatase alcalina (FA). A visualização é então obtida pela adição de um substrato a essas enzimas, produzindo produtos de cor insolúveis localizados em áreas onde os anticorpos primários estão ligados aos antígenos alvo. Uma melhor visualização pode ser obtida pela contracoloração, em que um corante é usado para criar um contraste entre tecido imunomarcado e não imunomarcado2.

Com a IHQ usando tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), a fixação de formalina pode anular a eficácia dos anticorpos primários devido à reticulação por formaldeído e ao aquecimento e desidratação durante a inclusão da parafina. Estas alteram a conformação das proteínas, destruindo, desnaturando ou mascarando os epítopos, diminuindo ou anulando sua detecção3. Como tal, isso requer recuperação de antígeno (AR). As técnicas de RA interrompem a ligação cruzada de grupos químicos relacionados ao formaldeído nas moléculas antigênicas, restaurando ou desmascarando a conformação antígeno-proteína original. Isso resulta na recuperação da afinidade anticorpo-antígeno (epítopo) para a imunomarcação. A eventual eficácia da RA depende das qualidades do antígeno alvo e/ou do anticorpo primário2.

A recuperação do antígeno induzido pelo calor (epítopo) (HIER) é um procedimento do AR3 e é usado rotineiramente para detecção de IHQPrP Sc , conforme descrito aqui. A imunoistoquímica é essencial para o diagnóstico e utilizada em laboratórios de pesquisa para determinar a distribuição tecidual de um antígeno associado à patologia. É amplamente utilizada no diagnóstico e pesquisa de câncer, neurociências, doenças infecciosas4, entre outras. Para EET, a IHQ desempenha um papel importante no diagnóstico e na pesquisa para confirmar e investigar a distribuição dePrP Sc em hospedeiros naturais e modelos experimentais. A IHQ contribui para estudos de patogênese priônica e análise de tipos e padrões de deposição dePrP Sc , ou seja, em tecidosneurais5, para detectar desvios de infecções rotineiramente descritas e identificar possíveis novas cepas de príons.

Uma vez que os priões da encefalopatia espongiforme bovina (EEB) podem infectar seres humanos, certos protocolos laboratoriais envolvidos no trabalho com a EEB podem exigir a utilização de instalações e práticas de BSL-36. Estes incluem a utilização de um recipiente secundário selado para transportar potenciais amostras de tecidos infectados com EEB dentro do instituto e do laboratório. Inclui também a designação de áreas de contenção e de equipamento dedicado ao prião para a investigação e análise da BSE, sempre que possível. Isso é feito para evitar a contaminação fora da área de trabalho e proporcionar um espaço confinado, uma vez que os procedimentos de descontaminação se tornam necessários.

Assim, o Laboratório de Patologia do INIAV segue as instalaçõese práticas de nível de biossegurança 3 (BSL-3) recomendadas 6 para gerenciar amostras potenciais de tecidos infectados por príons de bovinos, pequenos ruminantes e cervídeos associados à vigilância de EET.

Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina incluídos em procedimentos de diagnóstico ou pesquisa de EET, especialmente no sistema nervoso central, podem ser potencialmente infecciosos. Assim, esses tecidos fixados devem ser tratados com ácido fórmico para reduzir a infectividade dos príons, se presentes, antes do processamento do tecido. Isso é realizado através da colocação de tecidos fixos e aparados (aproximadamente 2-4 mm de espessura) em um de processamento. O é então imerso em ácido fórmico a 98% (por 1 h). Após a imersão, os com tecidos são lavados em água corrente da torneira por 30 min e retornam ao fixador antes do processamento posterior. Se os cortes de tecido não forem tratados antes do processamento, os cortes de tecido pós-microtômicos devem ser imersos em ácido fórmico não diluído por pelo menos 5 minutos antes da coloração histológica7. O protocolo IHQ para PrPSc inclui uma etapa rotineira de desmascaramento de epítopos de ácido fórmico, servindo também para inativar príons7. Após essas etapas de inativação do príon, os tecidos fixados resultantes podem então ser processados em BSL-2 usando práticas BSL-2 padrão.

O requisito mínimo de amostragem de tecidos para o diagnóstico de EET em qualquer animal incluído na vigilância de EET é a recolha do tronco encefálico (ao nível do obex). Além disso, para a detecção de EEB e tremor epizoótico atípicos, recomenda-se que parte do cerebelo também seja coletada 1,8. Para o diagnóstico de DC, tanto os linfonodos do tronco encefálico (obex) quanto os retrofaríngeos devem ser testados, pois a PrP Sc pode ser detectada em tecidos linfoides semPrP Sc detectável no obex9, revisada por Machado et al.10.

A porção obex do tronco encefálico inclui os locais-alvo diagnósticos da EET, a saber, o núcleo vagal dorsal (DVN), o núcleo do trato solitário (NST) e o núcleo do trato espinhal do nervo trigêmeo (V). Estas zonas apresentam consistentemente acumulação bilateral dePrP Sc , mesmo nas fases iniciais da EEB e do tremor epizoótico clássico. Nos casos clínicos de EET avançada, todas as áreas de substância cinzenta no tronco encefálico apresentam ampla distribuição dePrP Sc11.

Antes da secção e processamento, as amostras de encéfalo são avaliadas (Figura 1) para verificar o grau de autólise e a presença de qualquer dano tecidual que possa comprometer a adequação da amostra para o diagnóstico confirmatório baseado em IHQ8. Para validar a integridade dos protocolos preparativos e dos resultados analíticos, as amostras de tecido positivas e negativas para EET são incluídas como controles em conjunto com a preparação de tecidos de casos de teste em cada ensaio.

Figure 1
Figura 1: O procedimento de IHCPrP Sc . Representação mostrando o passo-a-passo do procedimento de IHQPrP Sc , desde a desparafinização dos cortes teciduais até a eventual imunomarcação e detecção (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – anticorpo monoclonal; DAB – 3,3′ diaminobenzidina). Esta figura foi criada em BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

O procedimento IHC aqui descrito é um componente do projeto de pesquisa FAIRJ-CT98-7021, “O estabelecimento de uma rede europeia para a vigilância de EET de ruminantes e a padronização e harmonização do processo e critérios para a identificação de casos suspeitos”. Segue os critérios diagnósticos definidos pela Organização Mundial de Saúde Animal, WOAH (anteriormente denominado Office International des Épizooties, OIE)1 e Laboratório Europeu de Referência para EET em<sup class="xr…

Representative Results

Dado que a imunomarcação alvo não específica é possível, é importante determinar o nível de imunomarcação inespecífica em animais controles conhecidos negativos para EET. Esse é um passo importante para interpretar adequadamente a imunomarcação específica paraPrP Sc7 (Figura 2). Observou-se que a marcação não-alvo por anticorpos anti-PrP ocorre como discreta coloração intraneuronal de partículas finas (mais evidente no núcleo…

Discussion

As EET são doenças zoonóticas potenciais. Após o surgimento da BSE em 1986 no Reino Unido, Portugal tornou-se um dos Estados-Membros da União Europeia com maior incidência desta doença14,15. Para controlar esta doença, surgiram outras EET (tremor epizoótico clássico e atípico, variantes da EEB e, atualmente, a vigilância da doença crónica emaciante nos cervídeos), foram desenvolvidos mecanismos de vigilância pela Direção-Geral da Alimentação e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este artigo foi financiado pelo Projeto POCI-01-0145-FEDER-029947 “Avaliação do risco de doenças crónicas em Portugal” apoiado pela FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) – FEDER -Balcão2020. Além disso, os autores da unidade de investigação CECAV receberam financiamento da FCT, no âmbito do projeto UIDB/CVT/0772/2020.Agradecemos a Bruce C. Campbell, Diretor de Investigação (aposentado), Centro Regional de Investigação do Oeste, USDA, pela sua assistência.

Materials

Absolute ethanol  Labchem LB0507-9010 Undituled
         Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase
Vectastain Elite ABC kit Peroxidase
Vector Laboratories PK-6100 Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)  Vector Laboratories BA-2000-1.5 Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase  Vector Laboratories SK-4100 Prepare before use according to kit instructions.
Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber DAKO S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin Merck 115938 Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol  Labchem LB0507-9010
Glacial acetic acid  Merck 101830
Potassium alum Merck 1.01047.1000
Glycerin Merck 1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol.
Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w) Scharlau HI0136
Methanol  Sigma Aldrich 322415-2L
Formic acid 98% Merck 1.00264.1000 Undiluted
Microtome  Shandon-AS325 Microtome  Shandon-AS325
Mounting medium Entellan Merck 107960 Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS:
Horse normal serum

Gibco

16050-122 
Prepare final volume according to the number of sections in the assay
(200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11  BIORAD MCA2460 PrP 146-R154R171182
Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine.
According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum)
Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. 
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10  Cayman  Chemical Company  189710 PrP142-160
Bovine, not suitable for ovine
Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber Thermo Scientific  72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center  Thermo Scientific 73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack Thermo Scientific 73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water.
Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water)
Prepare on assay day. 
Tri-sodium citrate dihydrate Sigma-aldrich  S4641-500G
Citric acid Sigma Aldrich C0759
Staining jar and basket Deltalab  19360
19361
Superfrost Plus microscope slides VWR 631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6):
TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months)
Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. 
TRIZMA BASE Sigma Aldrich T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Merck 106404
Xylene  Panreac Applied Chem ITW reagents 251769 Undiluted

References

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Cite This Article
Orge, L., Lurdes Pinto, M. d., Cristovão, P., Mendonça, P., Carvalho, P., Lima, C., Santos, H., Alves, A., Seixas, F., Pires, I., Gama, A., dos Anjos Pires, M. Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (195), e64560, doi:10.3791/64560 (2023).

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