İmmünohistokimya ile Anormal Prion Proteininin Saptanması

Summary

İmmünohistokimya protokollerini kullanarak anormal prion proteininin immüno-etiketlemesi, spesifik numune ve anti-PrP antikor hazırlama metodolojileri gerektirir. Bu protokol, uygun PrP immün etiketlemesini sağlamak ve spesifik olmayan arka plan boyamasını en aza indirmek için epitop demasking işlemindeki temel adımları açıklamaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım, prion ile enfekte olmuş dokularla immünohistokimya çalışmaları yaparken biyogüvenlik önlemlerini de göz önünde bulundurur.

Abstract

Anormal prion proteinleri (PrP^Sc), hücresel prion proteininin hastalıkla ilişkili izoformu ve bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin (TSE’ler) tanısal belirteçleridir. Bu nörodejeneratif hastalıklar insanları ve çeşitli hayvan türlerini etkiler ve scrapie, zoonotik sığır süngerimsi ensefalopati (BSE), servidlerin kronik israf hastalığı (CWD) ve yeni tanımlanan deve prion hastalığını (CPD) içerir. TSE’lerin tanısı, ensefalon dokularına, yani beyin sapına (obex seviyesi) hem immünohistokimya (IHC) hem de batı immünoblot yöntemlerinin (WB) uygulanması ile PrP^Sc’nin immün tespitine dayanır. IHC, bir doku kesitinin hücrelerinde tutulan antijenlere karşı primer antikorları (monoklonal veya poliklonal) kullanan yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Antikor-antijen bağlanması, antikorun hedeflendiği doku veya hücre bölgesinde lokalize kalan bir renk reaksiyonu ile görselleştirilebilir. Bu nedenle prion hastalıklarında, diğer araştırma alanlarında olduğu gibi, immünohistokimya teknikleri sadece tanı amaçlı değil, patogenez çalışmalarında da kullanılmaktadır. Bu tür çalışmalar, yeni prion suşlarını tanımlamak için daha önce tarif edilenlerden PrP^Sc modellerini ve tiplerini tespit etmeyi içerir. BSE insanları enfekte edebileceğinden, TSE gözetimine dahil edilen sığır, küçükbaş hayvan ve servid örneklerini işlemek için biyogüvenlik laboratuvarı seviye-3 (BSL-3) tesislerinin ve/veya uygulamalarının kullanılması önerilmektedir. Ek olarak, kontaminasyonu sınırlamak için mümkün olduğunda muhafaza ve priona özel ekipman önerilir. PrP^Sc IHC prosedürü, bu teknikte kullanılan formalin sabit ve parafin gömülü dokular bulaşıcı kaldığı için prion inaktivasyon önlemi olarak da işlev gören bir formik asit epitop demasking adımından oluşur. Sonuçları yorumlarken, spesifik olmayan immüno-etiketlemeyi hedef etiketlemeden ayırt etmek için özen gösterilmelidir. Bu amaçla, bilinen TSE-negatif kontrol hayvanlarında elde edilen immünoetiketleme artefaktlarını, TSE suşları, konakçı türler ve prnp genotipi arasında değişebilen spesifik PrP^Sc immünoetiketleme tiplerinden ayırt etmek için tanımak önemlidir.

Introduction

Prion hipotezine göre, anormal izoform (PrP^Sc), bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerde (TSE’ler) enfeksiyöz ajanın birincil veya tek bileşenidir. TSE tanısının doğrulanması, ensefalon dokularının immünohistokimya (IHC) protokolleri ve/veya batı immünoblot yöntemlerinin (WB) uygulanması ile PrP^Sc’nin immün tespitine dayanır¹.

IHC, bir doku kesitinin hücrelerinde bulunan spesifik olarak hedeflenmiş antijenlerin immünoboyanmasında ilk adım olarak monoklonal veya bazı durumlarda poliklonal antikorların (primer antikorlar olarak) kullanıldığı bir yöntemdir. Herhangi bir etkili primer antikor-antijen bağlanması daha sonra primer antikorlara özgü sekonder antikorlar kullanılarak görselleştirilir. Bu ikincil antikorlar, yaban turpu peroksidaz (HRP) veya alkalen fosfataz (AP) gibi enzimlere konjuge edilir. Görselleştirme daha sonra bu enzimlere bir substrat eklenerek elde edilir ve birincil antikorların hedeflenen antijenlere bağlandığı alanlarda lokalize çözünmeyen renk ürünleri üretilir. Geliştirilmiş görselleştirme, immüno-işaretli ve immüno-etiketsiz doku² arasında bir kontrast oluşturmak için bir boyanın kullanıldığı karşı boyama ile elde edilebilir.

Formalin ile sabitlenmiş parafin gömülü dokular (FFPE) kullanan IHC ile, formalin fiksasyonu, formaldehit ile çapraz bağlanma ve parafin gömme sırasında ısıtma ve dehidrasyon nedeniyle primer antikorların etkinliğini geçersiz kılabilir. Bunlar proteinlerin konformasyonunu değiştirir, epitopları yok eder, denatüre eder veya maskeler, böylece tespitlerini azaltır veya iptal eder³. Bu nedenle, bu antijen geri kazanımı (AR) gerektirir. AR teknikleri, antijenik moleküllerde formaldehit ile ilişkili kimyasal grup çapraz bağlanmasını bozar, böylece orijinal antijen-protein konformasyonunu geri yükler veya maskesini çıkarır. Bu, immünoetiketleme için antikor-antijen (epitop) afinitesinin geri kazanılmasıyla sonuçlanır. AR’nin nihai etkinliği, hedeflenen antijenin ve / veya birincil antikor^2’nin niteliklerine bağlıdır.

Isıya bağlı antijen (epitop) geri kazanımı (HIER), AR^3’ün bir prosedürüdür ve burada açıklandığı gibi PrP^Sc IHC tespiti için rutin olarak kullanılır. IHC tanı için gereklidir ve patoloji ile ilişkili bir antijenin doku dağılımını belirlemek için araştırma laboratuvarlarında kullanılır. Diğerlerinin yanı sıra kanser, sinirbilim ve^{bulaşıcı hastalıkların 4} teşhis ve araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. TSE’ler için IHC, doğal konakçılarda ve deneysel modellerde PrP^Sc dağılımının doğrulanması ve araştırılması için tanı ve araştırmada önemli bir rol oynamaktadır. IHC, prion patogenezi çalışmalarına ve rutin olarak tanımlanan enfeksiyonlardan sapmaları tespit etmek ve varsayılan yeni prion suşlarını tanımlamak için prion patogenezi çalışmalarına ve PrP^Sc birikim tiplerinin ve paternlerinin analizine, yani sinir dokularında^5’e katkıda bulunur.

Sığır süngerimsi ensefalopati prionları (BSE) insanları enfekte edebildiğinden, BSE ile yapılan çalışmalarda yer alan bazı laboratuvar protokolleri BSL-3 tesislerinin ve uygulamalarının kullanılmasını gerektirebilir⁶. Bunlar, potansiyel BSE ile enfekte olmuş doku örneklerini enstitü ve laboratuvar içinde taşımak için kapalı bir ikincil kap kullanmayı içerir. Ayrıca, mümkün olduğunda BSE araştırma ve analizi için muhafaza alanlarının ve priona özel ekipmanların belirlenmesini de içerir. Bu, çalışma alanı dışındaki kontaminasyonu önlemek ve dekontaminasyon prosedürleri gerekli hale geldiğinden sınırlı bir alan sağlamak için yapılır.

Buna göre, INIAV Patoloji Laboratuvarı, TSE sürveyansı ile ilişkili sığır, küçükbaş hayvan ve servidlerden potansiyel prion ile enfekte olmuş doku örneklerini^{yönetmek için önerilen} biyogüvenlik seviyesi-3 (BSL-3) tesislerini ve uygulamalarını 6 takip etmektedir.

TSE tanı veya araştırma prosedürlerinde yer alan formalin ile sabitlenmiş ve parafin gömülü dokular, özellikle merkezi sinir sisteminde, potansiyel olarak bulaşıcı olabilir. Bu nedenle, bu sabit dokular, eğer varsa, doku işlemeden önce prionların bulaşıcılığını azaltmak için formik asit ile muamele edilmelidir. Bu, sabit, kesilmiş dokuların (yaklaşık 2-4 mm kalınlığında) bir işleme kasetine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Kaset daha sonra% 98 formik aside batırılır (1 saat boyunca). Daldırma işleminden sonra, mendilli kasetler 30 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkanır ve daha fazla işlemden önce fiksatife geri döndürülür. Doku kesitleri işlenmeden önce tedavi edilmezse, post-mikrotomik doku kesitleri histolojik boyamadan önce en az 5 dakika seyreltilmemiş formik aside batırılmalıdır⁷. PrP^Sc için IHC protokolü, prionları inaktive etmeye de hizmet eden rutin bir formik asit epitop demasking adımı içerir⁷. Bu prion inaktivasyon adımlarından sonra, elde edilen sabit dokular daha sonra standart BSL-2 uygulamaları kullanılarak BSL-2’de işlenebilir.

TSE gözetimine dahil edilen herhangi bir hayvanda TSE tanısı için minimum doku örnekleme gereksinimi beyin sapının toplanmasıdır (obex seviyesinde). Ek olarak, atipik BSE ve scrapie’yi tespit etmek için, beyinciğin bir kısmının da toplanması önerilir ^1,8. CWD tanısı için, hem beyin sapı (obex) hem de retrofaringeal lenf nodları test edilmelidir, çünkü PrP Sc, obex^9’da saptanabilir PrP^Sc olmayan lenfoid dokularda tespit edilebilir, Machado ve ^ark.10 tarafından gözden geçirilmiştir.

Beyin sapının obeks kısmı, tanısal TSE hedef bölgelerini, yani dorsal vagal çekirdeği (DVN), soliter sistem çekirdeğini (STN) ve trigeminal sinirin spinal sistem çekirdeğini (V) içerir. Bu alanlar, BSE ve klasik scrapie’nin erken evrelerinde bile sürekli olarak bilateral PrP^Sc birikimi gösterir. İleri TSE’nin klinik vakalarında, beyin sapındaki tüm gri cevher alanları yaygın PrP^Sc dağılımı gösterir¹¹.

Bölümleme ve işlemeden önce, beyin örnekleri, otoliz seviyesini ve numunenin IHC tabanlı doğrulayıcı tanı için uygunluğunu potansiyel olarak tehlikeye atan herhangi bir doku hasarının varlığını belirlemek için değerlendirilir (Şekil 1)⁸. Hazırlayıcı protokollerin ve analitik sonuçların bütünlüğünü doğrulamak için, TSE pozitif ve negatif doku örnekleri, her tahlilde test durumlarından dokuların hazırlanması ile birlikte kontrol olarak dahil edilir.

Resim 1: PrP^Sc IHC prosedürü. PrP^Sc IHC prosedürünün doku kesitlerinin deparafinizasyonundan nihai immünoboyama ve tespitine kadar adım adım sırasını gösteren gösterim (FFPE – Formalin-sabit parafin-gömülü; Mab – monoklonal antikor; DAB – 3,3′ diaminobenzidin). Bu rakam BioRender.com yılında oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

Burada açıklanan IHC prosedürü, FAIRJ-CT98-7021, “Ruminant TSE’nin gözetimi için bir Avrupa ağının kurulması ve şüpheli vakaların tanımlanması için süreç ve kriterlerin standardizasyonu ve uyumlaştırılması” araştırma projesinin bir bileşenidir. Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü, WOAH (daha önce Office International des Épizooties, OIE olarak adlandırılmıştır)1 ve hayvan TSE’leri 8,11 için Avrupa Referans …

Representative Results

Spesifik olmayan hedef immünoetiketlemenin mümkün olduğu göz önüne alındığında, bilinen TSE-negatif kontrol hayvanlarında spesifik olmayan immünoetiketleme seviyesinin belirlenmesi önemlidir. Bu, spesifik PrPSc immünoetiketleme7’yi doğru bir şekilde yorumlamak için önemli bir adımdır (Şekil 2). Anti-PrP antikorları tarafından hedef dışı etiketlemenin, ayrık intranöronal ince partikül boyama (hipoglossal çekirdekte ve…

Discussion

TSE’ler potansiyel zoonotik hastalıklardır. 1986 yılında Birleşik Krallık’ta BSE’nin ortaya çıkmasından sonra Portekiz, bu hastalığın görülme sıklığı^14,15 olan Avrupa Birliği Üye Devletlerinden biri haline gelmiştir. Bu hastalığın kontrol altına alınması için ortaya çıkan diğer TSE’ler (klasik ve atipik scrapie, BSE varyantları ve günümüzde servidlerde kronik israf hastalığının sürveyansı), Gıda ve Veterinerlik Genel Müd…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted