Обнаружение аномального прионного белка методом иммуногистохимии

Summary

Иммуномаркировка аномального прионного белка с использованием протоколов иммуногистохимии требует специфического образца и методологий подготовки антител против PrP. В настоящем протоколе описаны ключевые этапы демаскировки эпитопов для обеспечения надлежащей иммуномаркировки PrP и минимизации неспецифического фонового окрашивания. Также при таком подходе учитываются меры биобезопасности при проведении иммуногистохимических исследований с прион-инфицированными тканями.

Abstract

Аномальные прионные белки (PrP^Sc) представляют собой ассоциированную с заболеванием изоформу клеточного прионного белка и диагностические маркеры трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE). Эти нейродегенеративные заболевания поражают людей и несколько видов животных и включают скрепи, зоонозную губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), хроническую истощающую болезнь шейки матки (CWD) и недавно выявленную прионную болезнь верблюда (CPD). Диагностика TSE основана на иммунодетекции PrP^Sc с применением методов иммуногистохимии (ИГХ) и западного иммуноблоттинга (WB) на тканях головного мозга, а именно на стволе мозга (уровень obex). ИГХ является широко используемым методом, при котором используются первичные антитела (моноклональные или поликлональные) против интересующих антигенов в клетках среза ткани. Связывание антитела с антигеном может быть визуализировано с помощью цветовой реакции, которая остается локализованной в области ткани или клетки, где было нацелено антитело. Таким образом, при прионных заболеваниях, как и в других областях исследований, методы иммуногистохимии используются не только в диагностических целях, но и в исследованиях патогенеза. Такие исследования включают выявление паттернов и типов PrP^Sc из ранее описанных для идентификации новых прионных штаммов. Поскольку BSE может инфицировать людей, рекомендуется, чтобы лабораторные объекты биобезопасности уровня 3 (BSL-3) использовались для работы с крупным рогатым скотом, мелкими жвачными животными и образцами цервидов, включенными в эпиднадзор TSE. Кроме того, рекомендуется, когда это возможно, использовать защитную оболочку и оборудование, предназначенное для использования прионов, чтобы ограничить загрязнение. Процедура PrP^Sc IHC состоит из этапа демаскирования эпитопа муравьиной кислоты, который также действует как мера инактивации прионов, поскольку ткани, фиксированные формалином и залитые парафином, используемые в этом методе, остаются инфекционными. При интерпретации результатов необходимо соблюдать осторожность, чтобы отличить неспецифическую иммуномаркировку от целевой маркировки. С этой целью важно распознать артефакты иммуномаркирования, полученные у известных TSE-отрицательных контрольных животных, чтобы дифференцировать их от специфических типов иммуномечения PrP^Sc , которые могут варьироваться между штаммами TSE, видами-хозяевами и генотипом prnp , далее описанными в настоящем описании.

Introduction

Согласно прионной гипотезе, аномальная изоформа (PrP^Sc) является первичным или единственным компонентом инфекционного агента при трансмиссивных губчатых энцефалопатиях (TSE). Подтверждение диагноза TSE основано на иммунодетекции PrP^Sc с применением протоколов иммуногистохимии (ИГХ) и/или западных иммуноблоттинговых методов (WB) тканей головного мозга¹.

ИГХ представляет собой метод, использующий моноклональные или, в некоторых случаях, поликлональные антитела (в качестве первичных антител) в качестве первого шага в иммуноокрашивании специфически целевых антигенов, представляющих интерес, расположенных в клетках среза ткани. Любое эффективное первичное связывание антитело-антиген затем визуализируется с использованием вторичных антител, специфичных к первичным антителам. Эти вторичные антитела конъюгированы с ферментами, такими как пероксидаза хрена (HRP) или щелочная фосфатаза (AP). Затем визуализация достигается путем добавления субстрата к этим ферментам, образуя нерастворимые цветные продукты, локализованные в областях, где первичные антитела связаны с целевыми антигенами. Улучшенная визуализация может быть достигнута путем контрокрашивания, при котором краситель используется для создания контраста между иммуномеченой и неиммуномеченной тканью².

При ИГХ с использованием фиксированных формалином тканей, встроенных в парафин (FFPE), фиксация формалина может свести на нет эффективность первичных антител из-за сшивания формальдегидом, а также нагревания и обезвоживания во время заделки парафина. Они изменяют конформацию белков, разрушая, денатурируя или маскируя эпитопы, тем самым уменьшая или отменяя их обнаружение³. Таким образом, это требует поиска антигена (AR). Методы AR нарушают сшивание химических групп, связанных с формальдегидом, в антигенных молекулах, тем самым восстанавливая или демаскируя исходную конформацию антиген-белок. Это приводит к восстановлению сродства антитело-антиген (эпитоп) к иммуномаркировке. Конечная эффективность АР зависит от качеств целевого антигена и/или первичного антитела².

Термоиндуцированный поиск антигена (эпитопа) (HIER) является одной из процедур AR³ и обычно используется для обнаружения PrP^Sc IHC, как описано в настоящем документе. ИГХ необходим для диагностики и используется в исследовательских лабораториях для определения тканевого распределения антигена, связанного с патологией. Он широко используется, в частности, для диагностики и исследования рака, неврологии и инфекционных заболеваний⁴. Для TSE ИГХ играет важную роль в диагностике и исследованиях для подтверждения и исследования распределения PrP^Sc в естественных хозяевах и экспериментальных моделях. ИГХ способствует изучению прионного патогенеза и анализу типов и паттернов отложения PrP^Sc , а именно в нервных тканях⁵, для выявления отклонений от обычно описанных инфекций и выявления предполагаемых новых прионных штаммов.

Поскольку прионы губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE) могут инфицировать людей, некоторые лабораторные протоколы, связанные с работой с BSE, могут потребовать использования оборудования и методов BSL-3⁶. К ним относятся использование герметичного вторичного контейнера для транспортировки потенциальных образцов тканей, инфицированных BSE, в институте и лаборатории. Это также включает в себя обозначение зон локализации и оборудования, предназначенного для исследований и анализа BSE, когда это возможно. Это делается для предотвращения загрязнения за пределами рабочей зоны и обеспечения замкнутого пространства, поскольку процедуры дезактивации становятся необходимыми.

Соответственно, Лаборатория патологии INIAV следует рекомендуемым объектам и практикам уровня^{биобезопасности 3} (BSL-3) 6 для управления потенциально инфицированными прионами образцами тканей крупного рогатого скота, мелких жвачных животных и цервидов, связанных с эпиднадзором TSE.

Ткани, закрепленные формалином и залитые парафином, включенные в диагностические или исследовательские процедуры TSE, особенно в центральной нервной системе, могут быть потенциально инфекционными. Следовательно, эти фиксированные ткани должны быть обработаны муравьиной кислотой, чтобы уменьшить инфекционность прионов, если они присутствуют, перед обработкой ткани. Это выполняется путем помещения фиксированных, обрезанных тканей (толщиной примерно 2-4 мм) в обрабатываемую кассету. Затем кассету погружают в 98% муравьиную кислоту (на 1 ч). После погружения кассеты с салфетками промывают в проточной водопроводной воде в течение 30 мин, а перед дальнейшей обработкой возвращают в фиксатор. Если срезы тканей не обработаны перед обработкой, постмикротомные срезы тканей должны быть погружены в неразбавленную муравьиную кислоту не менее чем на 5 мин перед гистологическим окрашиванием⁷. Протокол IHC для PrP^Sc включает в себя рутинную стадию демаскировки эпитопа муравьиной кислоты, также служащую для инактивации прионов⁷. После этих этапов инактивации прионов полученные фиксированные ткани могут быть обработаны в BSL-2 с использованием стандартных методов BSL-2.

Минимальным требованием к выборке тканей для диагностики TSE у любого животного, включенного в наблюдение TSE, является сбор ствола мозга (на уровне обекса). Кроме того, для выявления атипичных BSE и царапин рекомендуется также собрать часть мозжечка ^1,8. Для диагностики CWD следует тестировать как ствол головного мозга (obex), так и ретрофарингеальные лимфатические узлы, поскольку PrP Sc может быть обнаружен в лимфоидных тканях без обнаруживаемого PrP^Sc в obex⁹, рассмотренный Machado et ^al.10.

Обексная часть ствола мозга включает диагностические целевые участки TSE, а именно дорсальное ядро блуждающего нерва (DVN), ядро солитарного тракта (STN) и ядро спинномозгового тракта тройничного нерва (V). В этих областях последовательно присутствует двустороннее накопление PrP^Sc даже на ранних стадиях BSE и классического скрепи. В клинических случаях прогрессирующей TSE все области серого вещества в стволе мозга демонстрируют широко распространенное распределение PrP^{Sc 11}.

Перед секционированием и обработкой образцы мозга оценивают (рис. 1), чтобы определить уровень аутолиза и наличие каких-либо повреждений тканей, которые могут поставить под угрозу пригодность образца для подтверждающего диагноза на основе ИГХ⁸. Для проверки целостности препаративных протоколов и результатов анализа положительные и отрицательные образцы тканей TSE включаются в качестве контроля в сочетании с подготовкой тканей из тестовых случаев в каждом анализе.

Рисунок 1: Процедура PrP^Sc IHC. Представление, демонстрирующее пошаговую последовательность процедуры PrP^Sc IHC от депарафинизации срезов ткани до возможного иммуноокрашивания и обнаружения (FFPE – Формалин-фиксированный парафин-встраиваемый; Mab – моноклональное антитело; DAB – 3,3′ диаминобензидин). Эта фигура была создана в BioRender.com году. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Описанная в настоящем документе процедура IHC является компонентом исследовательского проекта FAIRJ-CT98-7021 «Создание европейской сети по надзору за жвачными животными TSE, а также стандартизация и гармонизация процесса и критериев для выявления подозрительных случаев». Он соответствует д?…

Representative Results

Учитывая, что неспецифическая целевая иммуномаркировка возможна, важно выяснить уровень неспецифической иммуномаркировки у известных TSE-отрицательных контрольных животных. Это важный шаг для правильной интерпретации специфической иммуномаркировки PrPSc 7 (<strong class="xf…

Discussion

TSE являются потенциальными зоонозными заболеваниями. После появления BSE в 1986 году в Соединенном Королевстве Португалия стала одним из государств-членов Европейского Союза с более высокой заболеваемостью этим заболеванием^14,15. Для борьбы с этим заболеван…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted