Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tredimensionell kultur av vaskulär termogen fettvävnad från mikrovaskulära fragment

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64650
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

Summary

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver användningen av mikrovaskulära fragment isolerade från gnagare eller mänsklig fettvävnad som ett enkelt tillvägagångssätt för att konstruera funktionell, vaskulariserad beige fettvävnad.

Abstract

Teknisk termogen fettvävnad (t.ex. beige eller brun fettvävnad) har undersökts som en potentiell terapi för metaboliska sjukdomar eller för design av personliga mikrovävnader för hälsoscreening och drogtestning. Nuvarande strategier är ofta ganska komplexa och misslyckas med att korrekt fullständigt skildra de multicellulära och funktionella egenskaperna hos termogena fettvävnad. Mikrovaskulära fragment, små intakta mikrokärl bestående av arteriole, venuler och kapillärer isolerade från fettvävnad, fungerar som en enda autolog källa till celler som möjliggör vaskularisering och fettvävnadsbildning. Denna artikel beskriver metoder för att optimera odlingsförhållanden för att möjliggöra generering av tredimensionella, vaskulariserade och funktionella termogena fettvävnader från mikrovaskulära fragment, inklusive protokoll för att isolera mikrovaskulära fragment från fettvävnad och odlingsförhållanden. Dessutom diskuteras bästa praxis, liksom tekniker för att karakterisera de konstruerade vävnaderna, och provresultat från både gnagare och humana mikrovaskulära fragment tillhandahålls. Detta tillvägagångssätt har potential att användas för förståelse och utveckling av behandlingar för fetma och metabola sjukdomar.

Introduction

Målet med detta protokoll är att beskriva ett tillvägagångssätt för att utveckla vaskulariserad beige fettvävnad från en enda, potentiellt autolog källa, mikrovaskulärt fragment (MVF). Bruna och beige fettvävnader har visat sig visa fördelaktiga egenskaper relaterade till metabolisk reglering; Den lilla volymen av dessa fettvävnadsdepåer hos vuxna begränsar dock den potentiella effekten på systemisk metabolism, särskilt vid sjuka tillstånd som fetma eller typ 2-diabetes 1,2,3,4,5,6,7. Det finns ett betydande intresse för brunt/beige fett som ett terapeutiskt mål för att förebygga de skadliga metaboliska effekterna i samband med fetma och dess samsjuklighet 8,9,10,11,12.

MVF är kärlstrukturer som kan isoleras direkt från fettvävnad, odlas och underhållas i en tredimensionell konfiguration under längretidsperioder 13,14,15. Tidigare arbete från vår grupp och andra har börjat utnyttja MVF: s multicellulära och multipotenta kapacitet, särskilt när det gäller fettvävnadsbildning16,17,18. Som en uppbyggnad av detta arbete visade vi nyligen att MVF härrörande från gnagarmodeller av frisk och typ 2-diabetes19 och från försökspersoner (vuxna över 50 år)20 innehöll celler som kunde induceras för att bilda termogen eller beige fettvävnad.

Häri är ett innovativt tillvägagångssätt från vilket en enda källa MVF används, inte bara kapabel att skapa beige fettvävnad utan också dess associerade och kritiska vaskulära komponent21. Användningen av denna teknik kan vara av stort värde för studier som letar efter en enkel vävnadskonstruerad metod för termogena fettvävnadsbildning. Till skillnad från andra metoder som strävar efter att konstruera beige fettvävnad 22,23,24,25,26,27,28, kräver processen som beskrivs i denna studie inte användning av flera celltyper eller komplexa induktionsregimer. Vaskulariserade beige och vita fettmodeller kan skapas med MVF som härrör från gnagare och mänskliga källor, vilket visar stor översättningspotential. Slutprodukten av detta protokoll är en konstruerad beige termogena fettvävnad med en struktur och metabolisk funktion jämförbar med brun fettvävnad. Sammantaget presenterar detta protokoll tanken att en lättillgänglig och eventuellt autolog källa MVF kan vara ett värdefullt terapeutiskt ingrepp och verktyg för att studera metaboliska störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersökningen genomfördes i enlighet med djurskyddslagen och tillämpningsföreskrifterna för djurskydd i enlighet med principerna i Vägledning för vård och användning av försöksdjur. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas i San Antonio.

OBS: För de steg som beskrivs nedan används Lewis-råttor av hankön. Små protokolljusteringar måste göras för en insamling av hona, såväl som musmikrovaskulärt fragment (MVF)29. För protokoll som använder humana MVF (h-MVF) är de enda steg som krävs resuspension av h-MVF enligt tillverkarens protokoll, beredning av tillväxtmedier (1.3), bildning av fibrinhydrogeler (5) och odling (6). För en översikt över protokollet, se figur 1.

Figure 1
Figur 1: Experimentell disposition. Uppdelning av sex viktiga steg, före analys, för bildandet av termogena fettvävnad med MVF. Klicka här för att se en större version av denna figur.

1. Beredning av reagens

OBS: Reagens nedan motsvarar en råtta, vägd och tillverkad inuti en biohood.

  1. Bered bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
    1. Förbered 10 mg/ml (1,0 %) BSA i PBS som ska spädas för tvättsteg (1 mg/ml, 0,1 %) och matsmältning (4 mg/ml, 0,4 %).
    2. Bered olika koncentrationer av BSA, såsom nämns i steg 1.1.1, enligt steg 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 mg/ml BSA i PBS (1 % BSA i PBS)
      1. Tillsätt 500 mg BSA och 500 ml PBS till ett 50 ml koniskt rör och virvla lösningen för att lösa upp BSA.
      2. Om alltför stora bubblor bildas, centrifugera lösningen vid 350 x g i 2 minuter. Filter sterilisera lösningen med ett 0,22 μm nylonnätfilter.
    4. 1 mg/ml BSA i PBS (0,1 % BSA i PBS)
      1. Späd 15 ml 10 mg / ml BSA i PBS 1:10 med PBS genom att tillsätta 15 ml 10 mg / ml BSA i PBS till 135 ml PBS i en 500 ml steril flaska och skaka försiktigt flaskan för att säkerställa en homogen blandning.
    5. 4 mg/ml BSA i PBS (0,4 % BSA i PBS)
      1. Späd 35 ml 10 mg / ml BSA i PBS 1: 2.5 med PBS genom att tillsätta 35 ml 10 mg / ml BSA i PBS + 57.5 ml PBS i en 100 ml steril flaska och skaka försiktigt flaskan för att säkerställa en homogen blandning.
  2. Förbered kollagenas i BSA för matsmältning av malet fettkuddar.
    1. Bered 6 mg/ml kollagenas.
      1. I ett 50 ml koniskt rör, väga 72 mg kollagenas (etikett "för Epi").
      2. I tre 50 ml koniska rör väger du 144 mg kollagenas (etikett "för Ing 1", "för Ing 2" och "för SubQ") vardera.
      3. Förvara det vägda kollagenaset vid 4 °C tills det används.
        OBS: Tillsätt inte BSA / PBS förrän strax före matsmältningen.
      4. Tillsätt 12 ml 4 mg/ml BSA i PBS till röret innehållande 72 mg kollagenas.
      5. Tillsätt 24 ml 4 mg/ml BSA i PBS till rören som innehåller 144 mg kollagenas.
      6. Skaka rören för att säkerställa en homogen lösning och filtrera, sterilisera lösningen med ett 0,22 μm nylonnätfilter.
  3. Förbered tillväxtmedier kompletterade med aminokapronsyra (ACA) för att mata / differentiera den isolerade MVF.
    1. Tillväxtmedia (GM): Komplettera DMEM med 20% FBS, 1% penicillin-streptomycin (pennstrep), 0,2% mykoplasma profylaktisk och 1 mg / ml ACA.
    2. Förbered vita adipogenic media (WAM).
      1. WAM-induktion: Komplettera DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pennstrep, 0,2% mykoplasma profylaktisk, 10 μg / ml insulin, 10 μm forskolin, 1 μm dexametason och 1 mg / ml ACA.
        OBS: För h-MVF, tillsätt dessutom 125 μM indometacin.
      2. WAM underhåll: Komplettera DMEM / F12 med 20% FBS, 1% penna strep, 0.2% mycoplasma profylaktisk, 5 μg / ml insulin och 1 mg / ml ACA.
        OBS: För h-MVF, ändra insulinkoncentrationen till 10 μg / ml.
    3. Förbered beige adipogenic media (BAM).
      1. BAM-induktion: Komplettera DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pennstrep, 0.2% mykoplasma profylaktisk, 10 μg / ml insulin, 10 μm forskolin, 1 μm dexametason, 1 μm rosiglitazon, 20 nM 3,3′,5-Trijod-L-tyronin (T3) och 1 mg / ml ACA.
        OBS: För h-MVF, ändra koncentrationen av T3 till 120 nM.
      2. BAM-underhåll: Komplettera DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pennstrep, 0.2% mykoplasma profylaktisk, 5 μg / ml insulin, 10 μm forskolin, 1 μm rosiglitazon, 20 nM T3 och 1 mg / ml ACA.
        OBS: För h-MVF, ändra insulinkoncentrationen till 10 μg/ml och T3-koncentrationen till 120 nM.
  4. Förbered trombin (behöver endast göras om den alikvoterade lösningen inte finns tillgänglig) för att göra koagulationsmedlet som ska användas i fibringeler.
    1. 10 E/ml trombin iddH2O:
      1. Återsuspendera trombinpulver med 1-5 mlddH2Oi injektionsflaskan från tillverkaren och överför resuspensionen till en 250 ml bägare.
      2. Ta upp lösningen till 100 ml och pipettera lösningen upp och ner flera gånger för att säkerställa en homogen blandning. Alikvot lösningen i 15 ml koniska rör (~10 ml/rör) och förvara alikvoterna i en frys på -20 °C.
        OBS: För att använda, tina trombinet vid rumstemperatur (RT).

2. Förberedelse av verktyg / material

OBS: All instrumentering ska autoklaveras/steriliseras före användning.

  1. Epididymal/inguinal/subkutan fettisolering (kirurgi ska utföras i ett definierat kirurgiskt område)
    1. Se till att det finns engångsunderkuddar, två saxar, en hemostat (tillval), två pincett och fyra 50 ml koniska rör med 10-15 ml 1 mg / ml BSA (0,1%) i PBS.
  2. Isolering av mikrovaskulära fragment
    1. För malning (som ska göras i en biohood), se till att det finns tre obelagda sterila 100 mm petriskålar, ett par pincett och ett par böjda saxar.
    2. För matsmältning och isolering (som ska göras i en biohood), se till att det finns en sax, ett par pincetter, åtta obelagda sterila 100 mm petriskålar, tre obelagda sterila 35 mm petriskålar, kollagenas vägda och vid 4 °C, fyra 250 ml kolvar, en plasthållare med ett hål i mitten, fyra 500 μM skärmar (skurna i 3 i rundade rutor), fyra 37 μM skärmar (skurna i 3 i rundade rutor) och 11 50 ml koniska rör.
  3. Resuspension av fibrin
    1. För fibrinhydrogeler (som ska göras i en biohood), se till att fibrinogen, trombin och tillväxtmedier (gjorda under reagensberedning) är tillgängliga.

3. Protokoll för fettisolering

  1. Preliminära steg
    1. Fyll en bägare med etanol för att tvätta och desinficera de kirurgiska instrumenten innan du använder dem. Förbered sedan bordet för hantering av råttan och ha ett vakuum redo att aspirera pälsen som genereras under rakningssteget.
    2. Förbered en hink med is där de tidigare beredda 50 ml koniska rören, var och en innehållande 10 ml 1 mg / ml BSA, kommer att placeras. Märk rören därefter.
      OBS: Det kan vara nödvändigt att ha två separata koniska rör för inguinalfettet, eftersom två sidor måste extraheras och mängden fett som samlas in från denna region tenderar att vara den största jämfört med bitestiklar och bakre subkutan.
    3. Börja med en avlivad råtta i det definierade kirurgiska området med nödvändiga kirurgiska verktyg. I allmänhet används CO2 för att avliva råttorna enligt IACUC-protokoll.
    4. Använd hårklippare och raka råttan runt intresseområdet. Specifikt rakning mellan ljumskarna och halva buken för epididymal och inguinal fettisolering (använd den mindre rakapparaten för pälsen i denna region). Raka hela ryggen för att få det bakre subkutana fettet som ligger mellan skulderbladen (det är bäst att använda en större rakapparat eftersom pälsen är tjockare på råttans baksida).
    5. Förbered råttan aseptiskt genom att spruta ner den med 70% etanol. I allmänhet rekommenderas att rengöra området som ska skäras två gånger.
  2. Isolering av olika fettdepåer
    1. Inguinal (subkutan)
      1. I ryggläge lyfter du huden under penis med en sax. Börja snittet med sax, börja i mitten och skär i sidled, bilda en "V" -form och slinga till råttans baksida för att komma åt hela fettdepån. Kom ihåg att skära ytligt så att fettet nedan är intakt. Under skärsteget, se till att huden separeras från fettet genom att skära av den sammankopplade fasciavävnaden (figur 2A).
      2. När fascian är korrekt skuren, se till att de två sidorna av inguinalfettet är synliga (inguinalfettet sträcker sig från ljumskområdet mot baksidan). Ta sedan bort fettet från de två sidorna i två separata koniska rör innehållande 10 ml 1 mg / ml BSA (figur 2B).
    2. Epididymal (visceral)
      1. Skörda bitestikelfettet genom att skära genom bukhuden och försiktigt genom det tunna lagret som omger testiklarna (figur 2C).
      2. Dra försiktigt ut fettvävnaden med pincett och skär ut den med sax. Undvik att dissekera några större synliga blodkärl (om testiklarna och bitestiklarna skördas, ta bort dem under rengöringssteget i biohuven).
      3. Placera försiktigt det borttagna fettet i ett 50 ml koniskt rör med 10 ml 1 mg / ml BSA i PBS.
        OBS: Avlägsnandet av bitestikelfettet bör göras efter att inguinalfettet har tagits bort. Bitestikelfettet är i allmänhet mindre i volym och ligger under inguinalfettet, under bukhuden som omger testiklarna och bitestiklarna.
    3. Bakre subkutan
      1. Vänd råttbenägen (ryggsidan uppåt) och skär med en stor sax huden på ryggen (huden i detta område är tjock) hela vägen upp till hårbotten, var försiktig så att du inte skär för djupt, strax under huden (figur 2D).
      2. Skär fascia som förbinder huden med vävnaden; Fettet ligger i den interscapulära regionen. Gör en anteckning för att skilja / separera det subkutana fettet från det bruna fettet. Det bruna fettet är närmare ryggraden (figur 2E).
      3. Isolera och placera fettet i motsvarande 50 ml koniska rör med 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS.

Figure 2
Figur 2: Isolering av olika fettvävnadsdepåer . (A) Initiala snitt som behövs för excision av inguinal fettvävnad. B) Ljumsmjölkepåns placering. c) Placering av bitestikelfettdepån, med angivande av det snitt av yttre skal som behövs för tillträde. (D) Ytterligare snitt som behövs när mössen placeras benägna att få tillgång till ytterligare fett. E) Placering av den bakre underhudsfettdepån. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Isoleringsprotokoll för mikrovaskulära fragment

  1. Placera 50 ml koniska rör som innehåller utskuret fett från råtta i biohuven.
  2. Använd pincett och placera fettet i en standard 100 mm petriskål (med ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA i PBS för att hålla vävnaden hydratiserad).
  3. Rengör och ta bort alla synliga blodkärl och muskler / främmande vävnad från fett.
  4. Finhacka fettet med sax i ~ 10 min (hacka tillräckligt så att det kan överföras med en 10 ml pipet).
  5. Kontrollera om klumpar genom att tillsätta ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA i PBS; Fortsätt hacka om det behövs.
  6. Överför finmalet fett till en steril 250 ml kolv med en 10 ml pipet.
    OBS: Notera volymen med en pipet.
  7. Tillsätt tillräckligt med BSA (1 mg/ml) så att den slutliga volymen blir 20 ml.
  8. Tillsätt 4 mg/ml BSA i PBS till kollagenas (slutlig koncentration av kollagenas: 6 mg/ml) (dvs. 12 ml för 72 mg kollagenas eller 24 ml för 144 mg kollagenas).
    OBS: Lägg inte till förrän malningen är klar eftersom den är tidskänslig.
  9. Skaka försiktigt det koniska röret för att säkerställa en homogen lösning och filtrera sterilisera lösningen med ett 0,22 μm nylonnätfilter.
  10. För bitestikelfett, smälta i ~ 8-10 min; för det inguinala och bakre subkutana fettet, smälta i ~ 15-20 min i ett 37 ° C vattenbad, skaka kolven i en cirkulär rörelse hela tiden (sluta i det ögonblick som fettet kommer till där det bara finns några klumpar kvar).
  11. Överför det smälta fettet till ett 50 ml koniskt rör (det ska finnas ~ 30 ml / rör) och märk röret som "smält fett".
  12. Snurra röret vid 400 x g i 4 minuter; efter spinning måste pelleten vara röd (figur 3A).
  13. Under centrifugeringen, placera den sterila 37 μM-skärmen och 500 μM-silarna i en steril petriskål med 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS för att förblöta före användning.
  14. Efter centrifugeringen, dekantera supernatanten i ett 50 ml koniskt rör märkt som "avfall". Utför dekanteringen försiktigt för att ta bort det ytliga fettet och för att inte störa pelleten av MVF.
  15. Tillsätt 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS till röret som innehåller pelleten ("smält fett"). Triturera (pipettera upp och ner) pelleten 2x.
  16. Undvik att vara för grov på pelleten för att inte störa fragmenten.
  17. Placera 500 μM-skärmen i en ny petriskål ovanför plastskärmhållaren (figur 3B).
  18. Pipettera 10 ml från röret "rötad pellet" över en skärm på 500 μM med hjälp av koncentriska cirklar (figur 3C).
  19. Tvätta filtret med ytterligare 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De önskade cellerna filtreras igenom i petriskålen; Kassera därför 500 μM-skärmen men spara den filtrerade vätskan inuti petriskålen.
  20. Placera 37 μM-skärmen i en ny petriskål ovanför plastskärmhållaren.
  21. Byt ut pipetten för att eliminera eventuella klumpar innan du använder 37 μM-skärmen.
  22. Pipettera vätskan som erhållits från den första filtreringen över 37 μM-skärmen med hjälp av koncentriska cirklar.
  23. Tvätta filtret med ytterligare 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De önskade cellerna kommer att förbli i filtret, kassera därför den filtrerade vätskan, men spara 37 μM-skärmen.
  24. Skjut in 37 μM-skärmen i en ny petriskål som innehåller 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS.
  25. Skaka skålen genom att knacka den mot en konisk hållare för att lossa fragmenten. Skaka inte för kraftigt, eftersom vätskan / cellerna kan spilla ut ur petriskålen.
  26. Skölj filtret med ytterligare 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De önskade cellerna kommer att förbli i flytande lösning i petriskålen. Spara 37 μM-skärmen och det lossnade fragmentet innehållande vätska inuti petriskålen för följande steg.
  27. Överför BSA + -fragmentet innehållande vätska till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
  28. Upprepa sköljningen av 37 μM-skärmen flera gånger till (varje gång med ~ 5 ml 1 mg / ml BSA i PBS) och tillsätt till det koniska röret. Upprepa tills den totala uppsamlade volymen är ~ 15-20 ml. I slutändan kommer de önskade cellerna att samlas in från den flytande lösningen i petriskålen och placeras i ett koniskt rör; Kassera nu 37 μM-skärmen efter den slutliga sköljningen men spara de lossnade fragmenten som innehåller vätska inuti det 50 ml koniska röret.
  29. Klipp änden av en 200 μL pipetspets med sax. Skaka försiktigt 50 ml röret, ta bort två prover på 20 μl och lägg dem i en ren 35 mm petriskål.
  30. Räkna antalet fragment i varje prov i petriskålen för att få det totala antalet MVF isolerade.
    Totalt antal fragment = Equation 1
  31. Snurra det återstående lossnade fragmentet innehållande vätska i ett 50 ml koniskt rör vid 400 x g i 4 minuter för att samla upp MVF.

Figure 3
Figur 3: Isolering av MVF. (A) Efter uppslutning av fettvävnaden, avbildning av MVF innehållande pellet och supernatant efter en spin-down. (B) Utformning av tillförsel för filtrering och infångning av MVF. (C) Illustration av den koncentriska cirkelmetoden för filtrerings-/tvättsteg. Klicka här för att se en större version av denna figur.

5. Bildning av fibrinhydrogeler

  1. Exempel på beräkningar:
    OBS: Nedan följer beräkningarna för MVF sådd vid ~ 15 000-20 000 MVF / ml och förhållandet fibrinogen: trombingel vid 2: 5, med fibrinogen som används vid en koncentration på 20 mg / ml.
    1. För tillverkning av fem 250 μL geler krävs en total volym på 1 250 μL. Ta alltid hänsyn till pipetteringsfel, gör därför tillräckligt för 1,5 ml geler.
      1. Beräkna volymen fibrinogen som krävs enligt följande:
        Equation 2, X1 = 428,57 μL fibrinogen
      2. Beräkna volymen trombin som krävs enligt följande:
        Equation 3, X2 = 1 071,43 μl trombin
      3. För den erforderliga volymen 428,57 μl, gör 500 μl fibrinogen enligt följande:
        20 mg/ml * 0,5 ml = 10 mg fibrinogen. Resuspendera detta i 500 μl DMEM
      4. För att erhålla varje gel, beräkna volymen fibrinogen och trombin enligt följande:
        1. Fibrinogen:
          Equation 4, X1 = 71,43 μL fibrinogen (i DMEM) + MVF
        2. Trombin:
          Equation 5, X2 = 178,57 μL trombin
  2. MVF fibrin gel gjutning
    1. Dekantera det mesta av vätskan i det nedknoppade fragmentet i det 50 ml koniska röret. Använd en pipett för att ta bort den lilla volymen vätska som fastnar på kanten av det koniska röret.
    2. Tillsätt trombin i brunnar där geler kommer att tillverkas (figur 4A).
    3. Klipp änden av en 200 μL pipetspets och suspendera MVF: erna försiktigt med fibrinogen för att erhålla en slutlig densitet på ~ 15 000-20 000 MVF / ml en gång i gelén.
    4. Kläm försiktigt fast änden av en 200 μL pipetspets och pipetter MVF+Fibrinogen i trombinlösningen. Pipettera snabbt upp och ner för att säkerställa en homogen blandning. Upprepa tills alla geler är gjorda (figur 4B).
    5. Placera brunnsplattan (plattorna) i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i ~ 15 minuter för att möjliggöra geltvärbindning (figur 4C).
    6. Tillsätt 100-150 μL tillväxtmedia till varje brunn.

Figure 4
Figur 4: Bildning av MVF-fibringeler . (A) En 5/7-del trombinblandning pipetteras in i motsvarande brunn. (B) Därefter, med en klippt pipetspets (för att inte störa MVF), pipetteras en 2/7-del fibrinogen + MVF-blandning i brunnen och blandas försiktigt. (C) Slutligen placeras alla färdiga geler i en inkubator vid 37 °C, så att hydrogelen kan stelna helt innan mediet placeras ovanpå. Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Odlingsförhållanden för MVF

  1. För odling av icke-vaskulariserad vit och beige fettvävnad (+ GM-kontroll), använd tidslinjerna19 som visas i figur 5.
  2. För odling av vaskulariserad vit och beige fettvävnad (+ GM-kontroll), använd tidslinjerna19 som visas i figur 6.
  3. Hydrogeler bör förvaras i en inkubator (37 °C, 5 %CO2) under hela odlingen för studien, och media byts varannan dag. För fixering och hantering av prover för analys, se tidigare publicerade arbeten16,19,20.

Figure 5
Figur 5: Tidpunkt för icke-vaskulariserad fettvävnadsbildning. Denna siffra har modifierats från Acosta et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Tidpunkt för bildning av vaskulariserad fettvävnad. Denna siffra har modifierats från Acosta et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det finns några viktiga fenotypiska morfologiska egenskaper hos beige/brun fettvävnad: den är multilokulär/innehåller små lipiddroppar, har ett stort antal mitokondrier (orsaken till dess karakteristiskt "brunaktiga" utseende in vivo), har på motsvarande sätt en hög syreförbrukningshastighet/mitokondriell bioenergetik, är starkt vaskulariserad, har ökat lipolys / insulinstimulerat glukosupptag, och, mest notoriskt, uttrycker höga nivåer av frikopplingsprotein 1 (UCP1), ett mitokondriellt protein involverat i termogen andning19,30.

Följaktligen, när vi karakteriserade MVF: s förmåga att differentiera till beige fettvävnad, genomfördes en analys som skulle göra det möjligt för oss att visualisera (figur 7, figur 8), genetiskt bekräfta (figur 9, figur 10) och funktionellt mäta (figur 11) omvandlingen av MVF.

I figur 7 och figur 8, genom användning av BODIPY, en lipidfläck och avbildning av hydrogelerna med hjälp av konfokalmikroskopi, sågs visualiseringen av lipidernas storlek och placering i de differentierade adipocyterna16,17,19. I denna analys, särskilt i jämförelse mellan förhållanden, bör BAM-grupperna uppvisa mindre lipidstorlekar (indikerar bildning av beige fettvävnad), kvantifierbara genom NIH ImageJ19,20.

Med RT-qPCR 16,19,20, i figur 9 och figur 10, mest distinkt, ökar uttrycket av UCP1 över hela linjen signifikant vid MVF-exponering för BAM.

Slutligen, när man tittar på mitokondriell bioenergetik (figur 11), är det uppenbart att BAM-grupper har karakteristiskt högre syreförbrukningsnivåer (OCR), mätt med ett Seahorse mito-stresstest19,20.

Figure 7
Figur 7: r-MVF histologisk utvärdering. Lean eller typ 2 diabetiker härledda r-MVF exponerades för antingen direkt (övre panelen, ADIPO) eller indirekt (nedre panelen, ANGIO + ADIPO) WAM eller BAM adipogenic media för att erhålla icke-vaskulariserad eller vaskulariserad vit eller beige fettvävnad (skalstänger = 200 μm). Denna siffra har modifierats från Acosta et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: h-MVF histologisk utvärdering. h-MVF exponerades för direkt (ADIPO) WAM eller BAM för att erhålla icke-vaskulariserad vit respektive beige fettvävnad (skalstänger = 200 μm). Denna siffra har modifierats från Gonzalez Porras et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: r-MVF-utvärdering genom RT-qPCR. Mager (L) eller typ 2 diabetiker (Db) härledd r-MVF exponerad för antingen (AC) direkt eller (E-G) indirekt WAM eller BAM utvärderades för (A, E) adipogenesis (Adiponectin), (B, F) termogenes (UCP1) och (C, G) angiogenes (ANGPT1). Resultaten rapporteras som medel- ± standardfel för två experimentella replikat (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 och **** = p < 0,0001. D0 = Dag 0. Tvåvägsanalys av varians (ANOVA) testar med Holm-Sidaks multipla jämförelseanalyser för att bestämma skillnader mellan grupper. Statistisk signifikans definierades som p < 0,05. Denna siffra har modifierats från Acosta et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: h-MVF-utvärdering genom RT-qPCR. h-MVF exponerade för direkt WAM eller BAM utvärderades för (A) adipogenesis (Adiponectin) och (B) termogenes (UCP1). Resultaten rapporteras som medel- ± standardfel för två experimentella replikat (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 och **** = p < 0,0001. Envägsanalys av varianstester (ANOVA) med Holm-Sidaks multipla jämförelseanalyser för att bestämma skillnader mellan grupper. Statistisk signifikans definierades som p < 0,05. Denna siffra har modifierats från Gonzalez Porras et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 11
Figur 11: r-MVF och h-MVF funktionsbedömning. Lean (L) eller typ 2 diabetiker (Db) härledda r-MVF exponerade för antingen (A) direkt eller (B) indirekt WAM eller BAM eller (C) h-MVF exponerade för direkt WAM eller BAM utvärderades funktionellt genom mätning av syreförbrukningshastighet (OCR). Resultaten rapporteras som medel- ± standardfel för två experimentella replikat (n = 4). Denna siffra har modifierats från Acosta et al.19. och Gonzalez Porras et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Området brun/beige fettvävnadsteknik är till stor del omoget 22,23,24,25,26,27,28, med huvuddelen av fettmodeller som utvecklas för vit fettvävnad 8,22,31. Konstruerade bruna / beige mikrovävnader består vanligtvis av flera cellkällor eller genetiska förändringar för att erhålla en delmängd av de fenotypiska egenskaperna hos inhemsk brun fettvävnad 8,11,32. Tillvägagångssättet som beskrivs här presenterar ett enanskaffat, potentiellt autologt 18,33-sätt att skapa funktionellt, strukturellt relevant och vaskulariserat beige fett med hjälp av mikrovaskulära fragment (MVF). MVF är framför allt kända som en källa till bildning av vit fettvävnad 14,16,17,1 8,34, även om vi nyligen har visat deras förmåga till beige fettbildning som härrör från gnagare, mänskliga och sjuka källor, som visas här 19,20. Med tanke på det stora intresset för att använda beige / brunt fett för sin terapeutiska eller sjukdomsmodelleringspotential, har denna teknik långtgående tillämpningar inom metabolism, fetma och relaterade sjukdomar.

Det finns flera viktiga punkter som beskrivs i protokollet. För det första finns det skillnader mellan användningen av råtta kontra mänskliga MVF. Användningen av gnagare (antingen från möss 29 eller råttor) har hittills i stor utsträckning dominerat forskningen med MVF, med arbete som tittar på dem i en mängd tillstånd som fetma 35, typ 1-diabetes 36,37, typ 2-diabetes 19 och åldrande 38, och till och med skillnader mellan fettdepåer 39 eller kön 40. Även om MVF, med tanke på deras ursprung, kan isoleras autologt från subkutana fettdepåer hos vuxna med hjälp av standard minimalt invasiva procedurer41, har MVF-baserad vaskularisering inte utförts i klinisk praxis. Prekliniska studier där humana MVF skördades från lipoaspirat har dock visat sin möjlighet18,33. För vår grupp specifikt, som visas i representativa data, är bildandet av vaskulariserad beige fettvävnad för närvarande begränsad till MVF härrörande från gnagare. Som tidigare visats av vår grupp och andra18 är det mycket känsligt att uppnå balansen mellan kärltillväxt och adipocytdifferentiering, visat sig vara beroende av de faktorer som införts42, och tidpunktsdifferentiering provoceras16. En begränsning av det beskrivna protokollet är att ytterligare utveckling behövs för att optimera de förhållanden som bidrar till vaskulariserad h-MVF beige fettvävnadsbildning. Dessutom behövs ytterligare arbete som tittar på svaret från dessa byggnadsställningar in vivo och härrör från andra sjuka tillstånd, tillsammans med tillhörande optimeringssteg.

Dessutom beskrivs här ett protokoll för isolering av r-MVF från tre olika fettvävnadsdepåer hos hanråttor. Tidigare arbete från Später et al.39 diskuterade skillnader mellan vaskulariseringsförmågan hos viscerala kontra subkutana depå-härledda MVF och noterade att subkutan depå MVF hade en minskad förmåga att vaskularisera, en egenskap som de tillskrev överskott av bindvävskontaminering. Det bör noteras att för våra studier, som presenteras här i "representativa data", användes endast de inguinala subkutana och bakre subkutana depåerna. Valet att enbart använda subkutan-härledda MVF gjordes för att närmare efterlikna translationella studier där lipoaspirat, eller liknande procedurer, samlar uteslutande subkutan fettvävnad. Dessutom har det faktum att in vivo-studier som pekar ut beige fettvävnad utvecklas inom subkutan fettvävnad, som innehåller en distinkt delmängd av preadipocyter eller vita adipocyter som transdifferentierar, gav en ytterligare motivering för vårt beslut43. Tidigare arbete från vår grupp visade inga märkbara skillnader mellan MVF som härrör från antingen viscerala eller subkutana depåer av friska gnagare för att genomgå både angiogenes och vit fettvävnadsbildning16. Alla dessa variabler bör beaktas vid utformningen av framtida studier.

Slutligen, när man försöker antingen ändra eller felsöka den beskrivna metoden, bör några viktiga punkter övervägas. För det första är steget att enzymatiskt smälta fettvävnaden extremt viktigt; särskild försiktighet bör iakttas och optimering säkerställas för att konsekvent reproducera MVF av liknande storlek och kvalitet. Med tanke på den stora variationen mellan fetttyper och fettvolymer (mycket beroende av djurens ålder, storlek, hälsa och vård vid tidpunkten för fettisolering [undvikande av föroreningar och extraktionseffektivitet]) kan tiden för matsmältningen variera, så intervall som bäst passar vår utrustning / djur tillhandahålls. Anpassning bör dock övervägas för optimala resultat. Vid hantering av MVF, under postenzymatisk matsmältning, bör särskild försiktighet vidtas för att undvika onödig grovhet och ytterligare bryta upp fragment. Slutligen bör man vara medveten om att medieformuleringar, hydrogelen av val44 och odlingsförhållanden är mycket anpassningsbara baserat på avsedda resultat. Som visas här har MVF som härrör från olika källor (t.ex. mager kontra diabetisk MVF) olika grader av differentiering, så vid utformning av experiment bör lämpliga kontroller och experimentgrupper inkluderas.

Sammanfattningsvis, när området för teknisk termogen fettvävnad växer, är det viktigt att konstruera biologisk-relevanta system som strukturellt, genetiskt och funktionellt efterliknar inhemsk beige / brun fettvävnad. MVF presenterar ett spännande och unikt tillvägagångssätt för denna utmaning, eftersom de, som beskrivs här, ger en enkel enda källmetod för att skapa biologiska imitationer av beige fett. Därför har de betydande potential för utnyttjande av förståelse eller utveckling av behandlingar för fetma och metabola sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Dr Acosta stöds av National Institutes of Health-bidragen CA148724 och TL1TR002647. Dr. Gonzalez Porras stöds av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases vid National Institutes of Health, under prisnummer F32-0DK122754. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (5SC1DK122578) och University of Texas at San Antonio Department of Biomedical Engineering. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Siffror skapades delvis med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061 (2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27 (2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38 (2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629 (2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022 (2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337 (2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395 (2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861 (2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523 (2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687 (2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114 (2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134 (2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Tags

Indragning utgåva 192
Tredimensionell kultur av vaskulär termogen fettvävnad från mikrovaskulära fragment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M.… More

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter