Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intakte korte, mellemliggende og lange skeletmuskelfibre opnået ved enzymatisk dissociation af seks bagbensmuskler hos mus: ud over flexor digitorum brevis

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokol til opnåelse af enzymatisk dissocierede fibre af forskellig længde og type fra seks muskler hos voksne mus: tre af dem allerede beskrevet (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) og tre af dem dissocieres med succes for første gang (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

Skeletmuskelfibre opnået ved enzymatisk dissociation af musemuskler er en nyttig model til fysiologiske eksperimenter. Imidlertid beskæftiger de fleste papirer sig med de korte fibre i flexor digitorum brevis (FDB), som begrænser omfanget af resultater, der beskæftiger sig med fibertyper, begrænser mængden af tilgængeligt biologisk materiale og hindrer en klar forbindelse mellem cellulære fysiologiske fænomener og tidligere biokemisk og dynamisk viden opnået i andre muskler.

Dette papir beskriver, hvordan man opnår intakte fibre fra seks muskler med forskellige fibertypeprofiler og længder. Ved hjælp af C57BL/6 voksne mus viser vi muskeldissektion og fiberisoleringsprotokol og demonstrerer fibrenes egnethed til Ca2+ forbigående undersøgelser og deres morfometriske karakterisering. Musklernes fibertypesammensætning præsenteres også. Når de blev dissocieret, blev alle muskler intakte, levende fibre, der trækker sig hurtigt sammen i mere end 24 timer. FDB gav korte (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) og peroneus longus (PL) gav mellemliggende (1-3 mm), mens extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL) og soleus muskler frigav lange (3-6 mm) fibre.

Når de blev registreret med det hurtige farvestof Mag-Fluo-4, viste Ca2+ transienter af PDQA-, PL- og EHL-fibre den hurtige, smalle kinetik, der minder om morfologitypen II (MT-II), kendt for at svare til type IIX- og IIB-fibre. Dette er i overensstemmelse med det faktum, at disse muskler har over 90% af type II fibre sammenlignet med FDB (~ 80%) og soleus (~ 65%). Ved at bevæge os ud over FDB demonstrerer vi for første gang dissociationen af flere muskler, hvilket gengiver fibre, der spænder over en række længder mellem 1 og 6 mm. Disse fibre er levedygtige og giver hurtige Ca2+ transienter, hvilket indikerer, at MT-II kan generaliseres til IIX og IIB hurtige fibre, uanset deres muskelkilde. Disse resultater øger tilgængeligheden af modeller til modne skeletmuskelundersøgelser.

Introduction

Den modne skeletmuskulatur hos pattedyr er et multifunktionelt væv. Det regulerer stærkt stofskiftet, er den vigtigste kilde til varmeproduktion, og dets dynamiske egenskaber giver det en nøglerolle i åndedræt, bevægelse af kropssegmenter eller forskydning fra et punkt til et andet 1,2,3. Skeletmuskulatur er også relevant for patofysiologien af mange sygdomme, herunder arvelige og kroniske tilstande, såsom myopatier, dystrofier eller sarkopeni, samt mange ikke-muskel kroniske tilstande, såsom kardiometaboliske sygdomme 3,4,5,6,7,8.

Ex vivo-undersøgelsen af modne skeletmusklers strukturelle og funktionelle egenskaber i forbindelse med sundhed og sygdom har hovedsagelig været mulig gennem to eksperimentelle modeller: hele muskler og isolerede fibre. I det 20. århundrede udnyttede forskere egenskaberne af hele, intakte extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior og gastrocnemius muskler af forskellige små arter som centrale modeller for at lære om motoriske enheder, fibertyper og dynamiske egenskaber såsom kraft og kinetik af sammentrækning og afslapning 9,10,11,12,13,14,15,16. Fremkomsten af mere raffinerede cellebiologiske undersøgelser flyttede imidlertid området mod undersøgelsen af enkeltmuskelfibre. Banebrydende arbejde muliggjorde derefter isolering af intakte flexor digitorum brevis (FDB) fibre af rotter ved enzymatisk dissociation til efterfølgende karakterisering 17,18,19. Selvom FDB-fibre også kan opnås ved manuel dissektion20, har letheden og den høje gennemstrømning af enzymatisk dissociation af murinmuskler ud over deres egnethed til en række eksperimentelle tilgange gjort sidstnævnte model meget udbredt i løbet af de sidste to årtier.

De korte FDB-fibre er velegnede til elektrofysiologiske og andre biofysiske undersøgelser, biokemiske, metaboliske og farmakologiske analyser, elektron- og fluorescensmikroskopiforsøg, transfektion til cellebiologiske tilgange eller som kilde til stamceller i myogeneseundersøgelser 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Men kun at bruge FDB-fibre i muskeleksperimenter indsnævrer omfanget af forskning, der beskæftiger sig med fibertyper og begrænser mængden af biologisk materiale, der er tilgængeligt for nogle metodologiske teknikker eller for at få mere information fra et dyr. Disse begrænsninger hindrer en klar sammenhæng mellem cellulære fysiologiske fænomener og tidligere biokemiske og dynamiske undersøgelser udført i forskellige hele, intakte muskler (f.eks. EDL, soleus, peronei).

Ved at overvinde disse begrænsninger lykkedes det nogle grupper at adskille de længere EDL- og soleusmuskler 24,33,34,35,36,37,38,39,40, hvilket åbnede døren for yderligere at udvide metoden til andre relevante muskler. Imidlertid er brugen af EDL- og soleusfibre stadig knappe, sandsynligvis på grund af manglen på metodologiske detaljer for at få dem som intakte fibre. Her beskriver vi detaljeret, hvordan man isolerer fibre af forskellig længde og type fra seks muskler: tre af dem allerede beskrevet (FDB, EDL og soleus) og tre af dem dissocieres med succes for første gang (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL] og peroneus digiti quarti [PDQA]). Resultaterne af dette arbejde bekræfter, at modellen af enzymatisk dissocierede fibre er velegnet til en bred vifte af undersøgelser og fremtidige korrelationer med tidligere offentliggjorte data, hvilket øger tilgængeligheden af modeller til modne skeletmuskelstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Udvalget for Etik i Forsøg med Dyr ved University of Antioquia (UdeA) (protokol 104 af 21. juni 2016 og 005 af 15. april 2021) i henhold til lov 84 af 1989 og resolution 8430 af 1993 udstedt af den colombianske regering og blev udført og rapporteret i overensstemmelse med dyreforskningen: Retningslinjer for rapportering af in vivo-eksperimenter (ARRIVE)41. Alle resultater, der præsenteres her, kommer fra sunde, 7-13 uger gamle, 20-26 g, C57BL/6 hanmus. Figur 1 viser den generelle udformning af denne undersøgelse og rækkefølgen af procedurerne. Alle reagenser, materialer og udstyrsdetaljer er angivet i materialetabellen.

1. Dyr

  1. Højst seks mus pr. gennemsigtigt, rektangulært akrylbur med træstrøelse under kontrollerede temperaturforhold (21 ± 2 °C) og lys:mørke (12:12 timer).
  2. Giv dyrene fri adgang til mad og postevand i specifikke patogenfrie dyrefaciliteter uden miljøberigelse.

2. Dissektion

  1. Opløsninger, materialer og reagenser
    1. Arbejdsopløsningerne fremstilles og filtreres (0,22 μm) med følgende sammensætning (alle koncentrationer i mM):
      1. Tyrod: 5,4 KCl, 1MgCl2, 140 NaCl, 0,33NaH2PO4, 2CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissociation: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Fosfatbufret saltvand (PBS): 137 NaCl, 8,6Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH7,34
    2. Forbered to dissektionskamre; stereoskop; betjening saks; fin saks; fine tang; og rene, gennemsigtige, ikke-koniske, 1-1,5 cm brede, glas hætteglas med 3-4 ml total volumen med hætter. Arranger et system til elektrisk stimulering af musklerne i dissektionskamrene.
    3. Forbered brandpolerede Pasteur-glaspipetter med forskellige breddespidser: 5, 4, 3, 2 og 1 mm.
    4. Indstil vandbadet til 37 °C. Der afvejes delprøver af 3 mg kollagenase type 2.
  2. Procedure
    1. Ofre musen ved hjælp af metoder, der er godkendt af den lokale etiske komité. Cervikal dislokation anbefales, fordi det er hurtigt, mindre stressende og undgår udsættelse for lægemidler, som kan påvirke muskelvævet (såsom CO2 eller nogle anæstetika). Start dissektion med det samme for at opnå bedre resultater.
    2. Placer musen på en skumoverflade og tape eller pin forbenene. Skær begge bagben over knæene med betjeningssaksen, overfør hver af dem til et separat dissektionskammer, og tilsæt kold (10-20 ° C) Tyrode for at dække vævet.
      BEMÆRK: Hvert bagben giver seks forskellige muskler i følgende rækkefølge: FDB, soleus, EDL, EHL, PL og PDQA. Detaljerede anatomiske referencer til dissekering af de seks muskler, der er intakte fra sene til sene, er givet i figur 2 og andre steder42.
    3. Fastgør det første bagben til dissektionskammeret i en position, hvor benets bageste side er synlig. Fjern huden under forstørrelse; udsæt og fjern derefter FDB (figur 2). Opbevar det i et mærket hætteglas med 1 ml Tyrode-opløsning.
      BEMÆRK: Passende forstørrelse og forudgående træning er påkrævet for at undgå uønsket snit i muskelvævet.
    4. Udsæt, fjern og opbevar soleus i et separat hætteglas med 1 ml tyrod. Brug en fin saks til først at adskille gastrocnemius og derefter fjerne soleus, som angivet i figur 2.
    5. Udsæt benets forreste ansigt, fjern huden og identificer de distale sener i tibialis anterior og EDL-musklerne i anklen. Fjern og kassér tibialis; skær derefter EDL's distale sener (figur 2). Fortsæt dissektionen, indtil EDL fjernes, og læg den i et separat hætteglas med 1 ml tyrod.
    6. Fjern EHL-musklen, som ligger lige bagved og medial til EDL. Start dissektion ved at identificere og følge senen til 1. ciffer, som angivet i det tilsvarende panel i figur 2. Opbevar musklen i et separat hætteglas med 1 ml tyrod.
    7. Identificer og følg peroneiens mest eksterne sene for at skære den og fjerne PL-musklen (figur 2). Anbring musklen i et separat hætteglas med 1 ml tyrod.
    8. Identificer og følg senen til 4. ciffer; skær det og fjern PDQA-musklen (figur 2). Anbring det i et separat hætteglas med 1 ml tyrod.
    9. Gentag proceduren med den anden bagben.
    10. Saml begge muskler af samme type i et mærket hætteglas af glas eller en lille petriskål med Tyrode-opløsning.
      BEMÆRK: Hvis mere end to par muskler planlægges dissekeret under en arbejdssession, rekrutteres to forskere til dissektionsproceduren.

3. Protokol til isolering af muskelfibre

  1. Forny Tyrode-opløsningen i dissektionskamrene for at fjerne snavs og musepels. Hæld FDB-musklerne i et dissektionskammer, kontroller deres integritet, og overfør dem til et nyt hætteglas af glas med 1 ml dissociationsopløsning. Gentag denne procedure med EHL-, PL- og PDQA-musklerne.
    BEMÆRK: Hvis en muskel ser hyperkontraheret, skåret ud eller ikke reagerer på den elektriske stimulering, skal du ikke fortsætte til næste protokoltrin. Optimer i stedet dissektionsprotokollen ved at verificere kvaliteten af opløsningerne (pH, forurening, osmolaritet) og få flere dissektionsfærdigheder (figur 1C og supplerende video S1).
  2. Udfør langsgående eller diagonale snit til soleus- og EDL-musklerne efter fibrenes orientering (figur 2). For soleus skal du følge den centrale sene og skære ~ 80% af dens længde. For EDL skal du bare følge en eller to sener og skære omtrent samme længde som for soleus. Sæt hvert par muskler i hætteglas af glas med 1 ml dissociationsopløsning.
    BEMÆRK: Denne procedure gør EDL og soleus mindre og gør det muligt for kollagenasen bedre at komme ind i vævet. Tilstrækkelig forstørrelse (40-50x) samt fin saks og tang er obligatorisk. Kontroller altid prøvens integritet ved visuel inspektion og elektrisk stimulering, før du fortsætter til næste trin i dissociationsprotokollen.
  3. Tilsæt 3 mg kollagenase type 2 (med en aktivitet på 250-300 E/mg) til hvert hætteglas, der indeholder 1 ml dissociationsopløsning og et par muskler. Standardiser den nøjagtige mængde kollagenase ved at overveje aktiviteten af den anvendte enzymbatch.
  4. Muskelparrene i vandbadet inkuberes i 65-90 minutter ved 36,8-37 °C under forsigtig omrystning.
    BEMÆRK: Vær streng med temperaturreguleringen. Standardiser proceduren, så musklerne ikke forbliver i kollagenase i mere end 100 minutter for at undgå skader.
  5. Kontroller hætteglassene under stereoskopforstørrelse hvert 5. minut efter det 65. inkubationsminut. Når musklerne ser lidt krusede, ujævne og løse ud, skal du forsigtigt ryste hætteglasset og kontrollere, om nogle fibre let begynder at løsne sig. Hvis dette er tilfældet, skal du vaske musklerne med Tyrode ved stuetemperatur for at inaktivere og fjerne kollaganasen.
    BEMÆRK: Vask skal udføres omhyggeligt uden at røre musklerne med pipetterne. Start med at tilføje 0,8 ml Tyrode og fjern derefter 0,8 ml af opløsningen. Gentag denne procedure 4-5x, og kontroller, at opløsningen bliver helt gennemsigtig.
  6. Adskil flere fibre fra hovedparten af musklerne med meget blid trituration i Tyrode ved hjælp af sættet af ildpolerede Pasteur-pipetter. Start med at omrøre opløsningen omkring musklen med den bredeste pipette (5 mm spids), og træk derefter forsigtigt musklerne op og ud af pipetten 3-4x. Når musklen begynder at frigive fibre og bliver tyndere, gentages proceduren med den næste pipette (4 mm spids).
    BEMÆRK: Fibre, der gengives via denne procedure, forbliver spændende og trækker sig hurtigt sammen i mere end 24 timer, som eksemplificeret ved hjælp af PL-, EDL-, EHL- og soleusfibre i supplerende video S2, supplerende video S3, supplerende video S4 og supplerende video S5.

4. Eksperimentelle procedurer

BEMÆRK: Isolerede fibre blev brugt til sarkoplasmatiske Ca2+ koncentrationsestimer, morfometriske målinger og myosin tunge kæde (MHC) ekspressionsundersøgelser.

  1. Måling af den sarkoplasmatiske Ca2+ koncentration under et ryk
    1. Monter en ren glasrutsjebane på det eksperimentelle badekammer. Overtræk objektglasset med 2-3 μL laminin og lad det tørre i 30 s, før du hælder ~ 400 μL af fibersuspensionen på diaset. Lad fibrene klæbe til laminin i 10-15 minutter ved stuetemperatur.
    2. Monter forsøgskammeret på scenen i et omvendt mikroskop udstyret til epifluorescens (figur 3A).
    3. Fremkald enkelte træk for at verificere fibrenes levedygtighed ved at anvende rektangulære strømimpulser (0,8-1,2 ms) gennem de to platinelektroder placeret langs hver side af forsøgskammeret. Selv når den er fastgjort til laminin, er sammentrækningen af fibrene stadig synlig hovedsageligt i ekstremerne.
    4. Fyld fibrene med 3,5-4,5 μM af det hurtige Ca2+ farvestof Mag-Fluo-4, AM i 4-5 min i Tyrode-opløsning. Efter denne tid vaskes forsigtigt med Tyrode for at fjerne det ekstracellulære farvestof. Lad det intracellulære farvestof blive de-esterificeret i ~ 15-20 minutter under mørke forhold. Hold altid temperaturen under 22 °C for at undgå opdeling af farvestoffet.
      BEMÆRK: Forbered kun en bestand af Mag-Fluo-4, AM i dimethylsulfoxid (DMSO), således at den endelige koncentration af DMSO i belastningen af Tyrode-opløsningen er mindre end 0,5%.
    5. Fiberen belyses med en hvid lysemitterende diode (LED) og et filtersæt med følgende bølgelængder for excitation/dikroisk/emission: 450-490/510/515 nm (figur 3A).
      BEMÆRK: Alternative kilder til excitation omfatter kviksølv og xenonfluorescenslamper. Brug den lavest mulige intensitet og størrelse af excitationsstedet for at undgå fotoblegning af farvestoffet og beskadigelse af cellen.
    6. Fremkald fiberens Ca2+ respons (sarkoplasmatiske Ca2+ transienter) ved at anvende rektangulære strømimpulser (0,8-1,2 ms) gennem de to platinelektroder placeret langs hver side af forsøgskammeret ved 20-22 ° C.
    7. Opsaml og gem lyssignalerne med et olienedsænkningsmål på 40x langdistance, der er egnet til fluorescens, og et fotomultiplikatorrør (PMT) forbundet til en digitizer (figur 3A og supplerende video S6). Sørg for en skala i anskaffelsessoftwaren på 0-200 vilkårlige enheder (AU), og indstil eksperimentets hvilefluorescens (F-hvile) til 10 AU på denne skala ved at modulere størrelsen af excitationspunktet og forstærkningen af PMT. Når proceduren er standardiseret, skal du holde forstærkningen uændret fra det ene eksperiment til det andet og kun indstille skalaen gennem mindre justeringer i spotstørrelsen.
      BEMÆRK: Hvis der opstår bevægelsesartefakter, skal du bruge 20-30 μM N-benzyl-p-toluensulfonamid (BTS) i Tyrode-opløsningen.
    8. Analysér og kalibrer signalerne på følgende måde:
      1. Lowpass filtrerer hele sporingen ved 1 kHz.
      2. Beregn F-hvilen i 1 s af sporet, juster F-resten til 0, og mål den maksimale sarkoplasmatiske Ca2+ transients amplitude (F-top). Amplituden præsenteres som i ligning (1):
        Equation 1(1)
      3. Den maksimale koncentration af Ca2+ ([Ca2+], μM) beregnes ved hjælp af ligning (2)26 og følgende parametre: in situ-dissociationskonstant (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maksimal fluorescens (Fmax) på 150,9 AU, minimum fluorescens (Fmin) på 0,14 AU, Mag-Fluo-4-koncentration [D]T på 229,1 μM26. F-toppen blev allerede opnået i trin 4.1.8.2.
        Equation 2(2)
      4. Mål stigningstiden fra 10% til 90% af amplituden (RT, ms), varigheden ved halv maksimum (HW, ms) og henfaldstiden fra 90% til 10% af amplituden (DT, ms). Derefter estimeres henfaldskinetikken i henhold til en tilpasning til den bieksponentielle funktion (ligning 3):
        Equation 3(3)
      5. Gem værdierne for tidskonstanterne for henfald τ1 og τ2 (ms) og amplituderne A1 og A226.
  2. Morfometriske målinger
    1. Monter en ren glasrutsjebane på det eksperimentelle badekammer. Overtræk objektglasset med 2-3 μL laminin og lad det tørre i 30 s, før du hælder ~ 400 μL af fibersuspensionen på diaset. Lad fibrene klæbe til laminin i 10-15 minutter ved stuetemperatur.
    2. Fremkald enkelte træk for at verificere fibrenes levedygtighed ved at anvende rektangulære strømimpulser (0,8-1,2 ms) gennem de to platinelektroder placeret langs hver side af forsøgskammeret. Selv når den er fastgjort til laminin, er sammentrækningen af fibrene stadig synlig hovedsageligt i ekstremerne.
    3. Få billeder af de levende fibre ved hjælp af 10x og 20x mål og et kamera på mindst 5 megapixel monteret på et omvendt fluorescensmikroskop. Gem billederne i . TIFF-format til offline analyser.
      BEMÆRK: Et sæt ~ 2-6 billeder kan være nødvendigt for helt at fange en lang fiber.
    4. Billede en mikroskopmikrometerkalibreringslineal under samme forstørrelse. Gem billederne i . TIFF-format til offline analyser.
    5. Mål fibrenes længder og diametre ved hjælp af kalibreringsværktøjet i gratis software til billedanalyser som følger:
      1. Etabler en relation mellem pixels og den kendte afstand (μm) i billederne ved hjælp af mikroskopets mikrometerkalibreringslineal ved hjælp af værktøjet Analyze/Set scale som vist i supplerende figur S1.
      2. Mål længder en gang fra den ene spids til den anden af fiberen og diametre på 2-6 forskellige steder langs fiberen (1-2 målinger pr. billede, afhængigt af dens længde), som i supplerende figur S1.
      3. Rapporter værdien af længden (μm eller mm) og gennemsnittet af alle diametre (μm) målt pr. Fiber.
  3. Myosin tunge kædeekspressionsundersøgelser
    BEMÆRK: For detaljer om bestemmelse af MHC ved immunofluorescens43 og natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)33,44,45,46 i hele muskler, se venligst supplerende fil 1. Protokollen for fibertypning ved immunofluorescensbestemmelse af MHC i suspensionen af FDB-isolerede fibre er som følger:
    1. Overtræk hver af fem rene glasglas med 2-3 μL laminin og lad det tørre i 30 s, før du hælder ~ 300 μL fiberophæng på hvert dias. Lad fibrene klæbe til laminin i 4 timer ved stuetemperatur.
    2. Fastgør præparaterne med frysekølet acetone i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Vask forsigtigt 3x med PBS.
    4. Permeabilisere cellemembranerne med PBS suppleret med 0,7% Triton X-100 i 15 min ved stuetemperatur.
    5. Vask forsigtigt 3x med PBS suppleret med 0,2% bovin serumalbumin (BSA) og 0,04% Triton X-100, og bloker derefter med PBS med 2% BSA, 2% gedeseserum og 0,4% Triton X-100 i 30 minutter ved stuetemperatur.
    6. Vask forsigtigt 3x med PBS suppleret med 0,2% BSA og 0,04% Triton X-100 og inkuber med de primære antistoffer som følger:
      1. Fortynd hvert primært anti-MHC-antistof i et separat hætteglas i PBS med 1 % BSA og 0,04 % Triton X-100: anti-I (1:1.500), anti-II (1:600), anti-IIA (brug hele konditionerede medier fra hybridoma) og anti-IIB (1:500).
      2. Hvert objektglas inkuberes med ét antistof og det resterende objektglas med PBS som kontrol i 12-16 timer ved 4 °C.
        BEMÆRK: I denne protokol forblev fibre type IIX umærkede i alle prøver.
    7. Vask forsigtigt 3x med PBS og inkuber alle dias med det sekundære antistof (1:800) koblet til et fluorescerende grønt molekyle i 1-2 timer ved stuetemperatur.
    8. Plettekerner med 1 μg/ml Hoechst i 15 min.
    9. Vask forsigtigt 3x med PBS, tilsæt forsigtigt 20-40 μL monteringsmedium, og læg en dæksel.
      BEMÆRK: Skånsom udskiftning af opløsning og vask sikrer, at snesevis af fibre forbliver fastgjort til diaset, hvilket gør eksperimentet statistisk forsvarligt.
    10. Visualiser hvert dias ved hjælp af et 10x mål, der er egnet til fluorescens, og et filtersæt med følgende bølgelængder for excitation / dikroic / emission: 450-490/510/515 nm og tæl alle positive og negative fibre. Alternativt kan du erhverve fluorescensbilleder ved hjælp af de samme tekniske forhold og et kamera på mindst 5 megapixel monteret på et omvendt fluorescensmikroskop og gemme dem i . TIFF-format til offline analyser.
    11. Optag de positive og negative fibre af hvert dias i en database og beregn procentdelene af positive I-, IIA-, IIB- og samlede II-fibre baseret på det samlede antal fibre, der er til stede i det tilsvarende dias. Beregn procentdelen af IIX-fibre ved at trække summen af IIA + IIB fra procentdelen af samlede II-fibre. Anslå procentdelen af hybrid I / IIA-fibre ved at trække summen af I + II fra en værdi på 100%. Til sidst trækker procentdelen af hybridceller fra summen af I og II for at have de rene type I- og II-fibre.
      BEMÆRK: I MHC-sammensætningsundersøgelser betegnes fibertyper med stort bogstav, mens isoformer betegnes med små bogstaver46.
  4. Hæmatoxylin og eosin farvning
    1. Overtræk et rent glasglas med 2-3 μL laminin og lad det tørre i 30 s, før du hælder ~ 300 μL fiberophæng på diaset. Lad fibrene klæbe til laminin i 4 timer ved stuetemperatur.
    2. Fastgør præparatet med Carnoys opløsning (60% absolut ethanol, 30% chloroform, 10% eddikesyre) i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Inkuber med hæmatoxylin i 90 s.
    4. Vask forsigtigt 3x med postevand.
    5. Inkuber med 1% eosin Y fremstillet i 70% ethanol i 30 s.
    6. Vask forsigtigt 3x med postevand.
    7. Nedsænk 3x i absolut ethanol.
    8. Inkuber i xylol i 60 s.
    9. Tilsæt 20-40 μL monteringsmedium og visualiser med et konventionelt mikroskop. Hent billeder med den ønskede forstørrelse ved hjælp af et farvekamera på mindst 5 megapixel.

5. Statistiske analyser og graftegninger

BEMÆRK: Den eksperimentelle enhed er en muskelfiber.

  1. Udtrykkes resultater som gennemsnit ± standardafvigelse og konfidensintervaller beregnes 95% (CI95%) for nogle analyser.
  2. For at sammenligne længde, diameter og Ca2+ transienters kinetik mellem grupper, udfør variansanalyse (ANOVA) og post-hoc tests med korrektion af Bonferroni.
  3. Vurder normalitet og varianslighed ved hjælp af henholdsvis Shapiro-Wilk og Levenes test.
  4. Overvej forskellene signifikante, når p < 0, 05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sarkoplasmatisk Ca2+ koncentration under et ryk
For at demonstrere gennemførligheden af fysiologiske eksperimenter i sættet af dissocierede fibre og for at udvide vores tidligere resultater om excitations-kontraktionskobling (ECC) og fibertyper blev Ca2+ transienter erhvervet i fibre fra alle muskler. For det første viste FDB (n = 5) og EDL (n = 7) Ca2+ kinetik kendt som morfologi type II (MT-II). Disse er hurtige, spidse signaler, hvis RT varer ~ 1 ms; dens henfaldsfase kan udstyres med en bieksponentiel funktion med den første komponent (A1) større end 30% af hele amplituden, og dens top [Ca2+] er mellem 15 og 30 μM33,47 (figur 3B). Deres resultater er samlet (n = 12) i første kolonne i tabel 1, mens resultaterne af soleus' Ca2+ transienter (n = 6) er præsenteret i anden kolonne i tabel 1. Solus' signaler blev klassificeret som morfologi type I (MT-I, FIGUR 3B) -bredere, med en RT over 1,2 ms, en A1 lavere end 30% og en top [Ca2+] mellem 7 og 13 μM33,47. Disse to kolonner blev betragtet som referencer til sammenligning af Ca2+ transienter i de nye muskler. Da alle fibre fra PDQA (n = 4), PL (n = 6) og EHL (n = 4) delte MT-II (figur 3B), samles deres data (n = 14) i tredje kolonne i tabel 1. Disse signaler viste en gennemsnitlig RT på ~1 ms, en A1 på ~45%, en top [Ca2+] over 15 μM, og sammenligner meget godt med resultaterne i første kolonne, men adskiller sig klart fra dem, der er vist i anden kolonne, som bekræftet af den statistiske analyse (tabel 1). Det hurtigste signal fra hele prøven kom fra en EHL-fiber med en ΔF / F på 0,66, [Ca2+] på 16,99 μM, RT på 0,85 ms, HW på 2,42 ms og DT på 10,56 ms. τ1 og τ2 var henholdsvis 1,63 og 7,21 ms, mens A1 og A2 værdier var 56,60% og 43,40%. Det langsomste signal kom fra en soleusfiber med en ΔF / F på 0,41, [Ca2+] på 9,76 μM, RT på 1,56 ms, HW på 9,43 ms og DT på 31,88 ms. τ1 og τ2 var henholdsvis 2,81 og 96,42 ms, mens A1 og A2 værdier var 19,55% og 80,45%. 

Et batteri af korte, mellemliggende og lange fibre
Observationen af klare forskelle mellem fibrene i henhold til deres muskelkilde muliggjorde en mere fuldstændig morfometrisk karakterisering. Histogrammerne i figur 4 viser slående variationer i fibrenes længder på tværs af alle muskler. Dette fremhæves, når man sammenligner den korteste fiber fra FDB (227,06 μm) med den længste fra soleus (5,69 mm). Gennemsnitslængdeværdierne er opsummeret i tabel 2. Der var betydelige statistiske forskelle mellem grupperne (p < 0,01). Disse resultater tillader klassificering af FDB-fibre som korte (<1 mm); PDQA og PL som mellemprodukt (1 til 3 mm); og EDL, EHL og soleus så lange (>3 mm) (supplerende figur S2).

Omvendt blev der observeret mindre forskelle i de gennemsnitlige diametre af fibrene i alle muskler (tabel 2) og fordelingen af værdierne (figur 4). Alligevel var der betydelige statistiske forskelle mellem grupperne (p < 0,01). Ved detaljeret evaluering var der forskelle mellem FDB og hinanden muskel og mellem FDB (FDB 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) og puljen af mellemliggende og lange fibre (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). Den tyndeste celle i hele prøven målte 18,42 μm (FDB), og den tykkeste nåede 82,79 μm (PDQA).

Fibertyper anvendt i fysiologiske eksperimenter
For det første blev fibertyper, der var til stede i hver hel muskel, bestemt ved immunofluorescens. Bortset fra soleus viste musklerne en overvægt på over 76% af type II-fibre (supplerende figur S3, tabel 3 og tabel 4). EHL, PL og PDQA er særligt hurtige muskler med over 90% af hurtige fibre og op til 58,8% af type IIB-fibre, som findes i PDQA. EHL og PDQA var næsten blottet for type I-fibre. Hybrid I / IIA fibre var til stede i alle muskler i lave procentdele. Som forventet tegnede type I- og IIA-fibre sig for over 82% af soleusens samlede fibre. Denne muskel er næsten blottet for de hurtigste IIB-fibre. Ifølge profilen af fibertyper er soleus den langsomste, og PDQA er den hurtigste muskel af de seks analyserede.

Derefter, og fordi det er mere relevant for fysiologiske eksperimenter med enkeltfiber, blev spørgsmålet om, hvilke typer fibre der forekommer i cellesuspensionen afledt af den dissocierede FDB, behandlet. Det blev konstateret, at profilen af fibre i cellesuspensionen afspejler sammensætningen af fibre, der er til stede i kryosektionerne: tre ud af fire dissocierede fibre var type II (figur 5 og tabel 3).

Endelig blev musklernes sammensætning bekræftet ved at adskille deres MHC-isoformer gennem SDS-PAGE. Resultaterne var i overensstemmelse med det generelle mønster, der blev observeret i immunofluorescensanalyserne. Solusen blev beriget med MHC IIa og I, mens EDL, EHL og peronei blev beriget med MHC IIx og IIb, men var blottet for I (supplerende figur S4).

Figure 1
Figur 1: Undersøgelsens udformning. (A) Udstyr og løsninger, der skal oprettes, før dissektionsproceduren påbegyndes. 1. Stereoskop nummer et. 2. Fra bund til top: Et sæt med fem brandpolerede pipetter, dissektionsværktøjer og kollagenasehætteglas inde i en bærbar køleboks (gul kasse). 3. Filterhus, dissektionskammer, mærkede hætteglas med hætte, stativ med filtrerede opløsninger. 4. Dissektion værktøjer. 5. Stereoskop med dissektionskammernumre to koblet til et kamera og en elektrisk stimulator. (B) Dissektionsproceduren for sættet af seks bagbensmuskler hos mus som yderligere forklaret i figur 2. (C) Efter dissektion skal muskelkontraktion og integritet verificeres, før man fortsætter til næste protokoltrin. Den venstre muskel i venstre panel viser en bølget, hyperkontraheret, ikke-reagerende PL-muskel (blå pil), som ikke må bruges til at opnå dissocierede fibre. I stedet skal dissektionsprotokollen optimeres og startes igen. Den veldissekerede PL-modstykke (højre muskel i venstre panel) viser et langstrakt udseende og trækker sig synligt sammen (supplerende video S1). Panelet til højre viser to EDL (blå pil) og to FDB-muskler i kollagenaseopløsningen med det korrekte, lige udseende. (D) Når musklerne er dissocieret, hældes de isolerede fibre i forsøgskammeret og kontrolleres deres sammentrækning og integritet. På venstre panel, levende (blå pil) og døde PL fibre. På højre panel, levende (blå pil) og døde EDL-fibre. (E-G) Tre sæt eksperimenter blev udført med de isolerede fibre: (E) Sarkoplasmatiske Ca2+ koncentrationsmålinger under et træk (resultater i figur 3). F) Morfometriske analyser (resultaterne af figur 4). Dette eksempel viser en PL-fiber. (G) Immunofluorescens for myosin-tunge kædeekspressionsundersøgelser (resultater illustreret i figur 5). Dette eksempel viser en isoleret FDB-fiber. Skalastænger = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Anatomiske referencer og generel procedure til dissekering af sæt af seks bagbensmuskler i mus. Rækker, fra top til bund, præsenterer musklerne i henhold til den bedste rækkefølge af dissektion: FDB, soleus, EDL, EHL, PL og PDQA. Kolonner, fra venstre mod højre, præsenterer milepælene under dissektion. Den første kolonne viser musklerne eller deres distale sener eksponeret, så dissektionen kan starte. For eksempel peger blå pile på FDB og soleus in situ og på EDL's distale sener. De følgende to kolonner illustrerer selve dissektionen og de muskler, der eksponeres, efter at den eller de distale sener er skåret, som f.eks. mærket med den blå pil i EDL-rækken. Det anbefales, at FDB's filial rettet mod det femte ciffer fjernes. Den højre kolonne viser musklerne, når de er helt fjernet, med de proksimale sener orienteret mod den øverste del af billederne. Blå, diskontinuerlige linjer (yderste højre kolonne) illustrerer de langsgående eller diagonale snit, der skal udføres i soleus- og EDL-musklerne for at sikre, at kollagenasen kommer ind i deres bulk. Skalastænger = 5 mm. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ca2+ transienter registreret i fibre opnået fra et sæt af seks bagbensmuskler i mus. (A) Opsætning anvendt til erhvervelse af Ca2+ transienter under dæmpet belysning. Venstre panel: 1. PMT forbundet til et inverteret fluorescensmikroskop (2). 3. Kamera koblet til mikroskopet. 4. Elektrisk stimulator koblet til forsøgskammeret. 5. Mikromanipulationssystemet kan bruges, når elektrofysiologi og injektionsassays er planlagt til at supplere Ca2+ transienterne erhvervelse. Mellempanel: Forsøgskammeret (indsats) med de indlæste celler monteres på mikroskopets scene og belyses med blåt lys (450-490 nm, blå pil) for at ophidse farvestoffet. I denne opsætning placeres punkterne 1 til 5 over et antivibrationsbord og inde i et Faradays bur. Højre panel: Når kvaliteten af sammentrækning og farvelægning er verificeret med kameraet (6), ledes det udsendte lys til PMT, den elektriske stimulering starter, og signalet føres til digitizeren (7) og til anskaffelsessoftwaren (8) for at optage Ca2+ transienten. Den integrerede funktion af disse elementer under et live eksperiment kan ses i supplerende video S6. (B) Repræsentative, kalibrerede Ca2+ transienter af FDB, PDQA, PL, EDL, EHL og soleus fibre af mus. De lignende, hurtige, smalle signaler fra FDB, PDQA, PL, EDL og EHL bekræfter, at de allerede har MT-II, der allerede vides at stamme fra IIX- og IIB-fibre, som er de mest rigelige i disse muskler. I modsætning hertil er soleus transient langsommere og mindre, typisk for MT-I, oprindeligt beskrevet i I- og IIA-fibre. Den røde kurve over EDL- og soleussignalerne viser, at henfaldsfasen af MT-I og MT-II kan udstyres med en bieksponentiel henfaldsfunktion. Kalibreringsbjælker gælder for alle paneler. Lodret stang = 2,5 μM [Ca2+], vandret stang = 10 ms. Farvetasten i bunden hjælper med at identificere musklerne. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PMT = fotomultiplikatorrør; MT-I = morfologi type I; MT-II = morfologi type II. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Morfometriske målinger af de korte, mellemliggende og lange fibre opnået ved enzymatisk dissociation af sættet af seks bagbensmuskler i mus. Intakte, sunde, repræsentative fibre fra hver muskel er afbildet i de venstre søjlepaneler. Billeder blev kun redigeret for at reducere baggrundsstøj og forbedre kontrasten uden direkte manipulation af muskelfibrene. Skalastænger = 100 μm (alle paneler). Måleprotokollen samt udseendet og kvaliteten af de komplette lange fibre kan ses yderligere i supplerende figur S1. Midterste kolonne viser fordelingen af længder, ordnet fra den muskel, der gengav de korteste fibre (FDB), til den med de længste fibre (soleus). Der er et kontinuum af længder, så der er en vis overlapning mellem musklerne, der spænder over i alt ~ 5,5 mm. Diameterfordelinger vises i kolonnepanelerne yderst til højre. De fleste fibre er mellem 30 og 60 μm, med små forskelle mellem musklerne. Test-retest-analyser (n = 78 fibre, svarende til 9,85% af hele prøven af n = 792) af de morfometriske målinger viste meget høj reproducerbarhed (gennemsnitlig variationskoefficient på 1,77%-konfidensinterval 95%, CI95%, 1,26-2,27%-gennemsnitlig korrelationskoefficient på 0,99 (CI95% 0,98-0,99)), hvilket fremhæver resultaternes gode pålidelighed. Gaussiske distributionskurver blev tilføjet med graflicenseret software. Supplerende figur S2 viser søjlediagrammer af middelværdierne for længde og diameter og sammensmeltningerne af længde- og diameterfordelinger af alle muskler for lettere sammenligning. Farvenøgle i bunden hjælper med at identificere musklerne. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL, = extensor hallucis longus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Immunofluorescensanalyser for fibertyper i cellesuspensionen i dissocierede FDB-muskler. Billeder af forskellige felter viser intakte, dissocierede FDB-fibre klæbet til bunden af diasene. (A) En antimyosin II-positiv fiber (grøn fluorescens, diagonal lyseblå pil) står klart i kontrast til en negativ (lyseblå pilespids), hvilket demonstrerer analysens diskriminationskraft. Tilstedeværelsen af begge fibre i billedet kan bekræftes på grund af mærkning af kernerne (blå fluorescens). (B) Et andet felt viser en anden antimyosin II-positiv fiber. (C) Den korrekte identifikation af myosin tunge kæde i A-båndene (grøn fluorescens) af antistofferne blev bekræftet ved hjælp af konfokal mikroskopi. De mest berygtede tværgående sorte striber svarer til I-båndene, beriget med actin, og forventes således ikke at blive genkendt af antistofferne. (D) Hæmatoxylin mærker i lilla de typiske perifere, rigelige kerner, og eosin mærker fiberens sarkoplasma, der viser en intakt, moden celle. Skalastænger = 50 μm (A, B, D); 10 μm (C). Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Fibre FDB og EDL Soleus PDQA, PL og EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0,68±0,15 0,46±0,06*,† 0,66±0,12 <0,01
[Ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0,01
RT (ms) 0,95±0,10 1.26±0.20*,† 0,95±0,09 <0,01
Stigning hældning (F/ms) 5.97±1.41 3.12±0.79*,† 5.83±0.97 <0,01
HW (ms) 3,59±0,85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0,01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0,01
Forfaldshældning (F/ms) -0,24±0,07 -0,10±0,03*,† -0,35±0,08* <0,01
T1 (MS) 1.86±0.37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0,05
T2 (MS) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0,01
A1 (%) 48.14±7.27 25.94±8.98*,† 44.59±8.29 <0,01
A2 (%) 51.86±7.27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0,01
Morfologi MT-II MT-I MT-II

Tabel 1: Ca2+ transienters kinetik i enzymatisk dissocierede fibre opnået fra et sæt af seks bagbensmuskler i mus. Værdier er middelværdi ± standardafvigelse. p-værdier svarer til variansanalysetesten. *Væsentligt forskellig fra FDB- og EDL-grupperne. †Væsentligt forskellig fra PDQA-, PL- og EHL-grupperne. Forkortelser: F = fluorescens; [Ca2+] = cytosolisk peak Ca2+ koncentration; RT = stigningstid; HW = varighed ved halv maksimum; DT = henfaldstid; τ1 og τ2 = tidskonstanter for forfald; A1 og A2 = amplituder af forfald; FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MT-I = morfologi type I; MT-II = morfologi type II.

Fibre FDB PDQA PL EDL EHL Soleus p
n 370 142 80 70 87 43
Længde (mm) 0,42±0,05* 2.20±0.26** 2,69±0,26† 3.51±0.53†† 3.83±0.44‡ 4.62±0.64 <0,01
Diameter (μm) 38.40±9.40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0,01

Tabel 2: Morfometriske målinger af de korte, mellemliggende og lange fibre opnået ved enzymatisk dissociation af sættet af seks bagbensmuskler i mus. Værdier er middelværdi ± standardafvigelse. p-værdier svarer til variansanalysetesten. *Statistisk forskellig fra PDQA, PL, EDL, EHL og soleus. **Væsentligt forskellig fra PL, EDL, EHL og soleus. †Væsentligt forskellig fra EDL, EHL og soleus. ††Væsentligt forskellig fra EHL og soleus. ‡Væsentligt forskellig fra soleus. Væsentligt forskellig fra EHL. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Muskler/fibre N n Type I + I/IIA i alt (%) Type II i alt (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

Tabel 3: Fibertyper i kryosektioner og i cellesuspensionen i dissocierede FDB-muskler i mus. Værdier er middelværdi ± standardafvigelse. N refererer til antallet af dyr, mens n refererer til det samlede antal fibre analyseret i forsøgene. FDB-række præsenterer data for hele musklen som bestemt i kryosektioner, mens *FDB-række svarer til isolerede fibre i cellesuspensionen efter dissociering af musklen. Kolonnen "Total type II" afspejler rene fibre type IIA, IIX og IIB. Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis.

Muskel N n Type I (%) Type I/IIA (%) Type IIA (%) Type IIX (%) Type IIB (%) Type II i alt (%)
PDQA 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35.85±5.66 35.66±9.36 94.52±3.90
EDL 4 826 0.00±0.00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89.56±8.33
EHL 5 618 0,24±0,76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
Soleus 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

Tabel 4: Fibertyper i kryosektioner af musklerne, som giver mellemliggende og lange fibre af mus. Værdier er middelværdi ± standardafvigelse. N refererer til antallet af dyr, mens n refererer til det samlede antal fibre analyseret i forsøgene. Alle rækker præsenterer data for hele musklen som bestemt i kryosektioner. Type I-, IIA-, IIX- og IIB-søjler afspejler rene fibre, mens I / IIA-søjlen refererer til hybridfibre. Kolonnen "Type II i alt" er summen af kolonnerne type IIA, IIX og IIB. Forkortelser: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Supplerende fil 1: Myosin tunge kædeekspressionsundersøgelser i hele muskler. Protokollerne præsenterer detaljer til bestemmelse af myosin-tungkædeisoformer ved immunofluorescens i kryosektioner og ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese i homogenater af hele musklerne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S1: Detaljer om morfologien af fibrene opnået ved enzymatisk dissociation af sættet af seks bagbensmuskler i mus. (A) Linealen til mikrometerkalibrering af mikroskopet, der er åben for indstilling af skalaen i billedanalysesoftwaren, vises til venstre. Det højre panel viser, hvordan diameteren gentagne gange blev målt som angivet med de blå linjer vinkelret på fiberens lange akse (blå pile), mens længden blev målt en gang fra spids til spids som illustreret af den blå linje langs fiberens hovedakse. (B) Flere billeder blev samlet med mindre redigering for at demonstrere det lange og sunde udseende af PDQA, PL, EDL, EHL og soleus fibre (små blå, grønne, gule, orange og lyserøde indsatser). De samlede billeder blev yderligere redigeret for at give fibrene et bedre udseende (store, sorte og hvide billeder). (C) DIC-billeder af FDB-, PDQA-, PL- og soleusfibre, der fremhæver den normale uregelmæssighed af deres spids og deres velkendte tværgående striber. DIC-udseendet af de resterende EDL- og EHL-fibre kan ses i supplerende video S3 og supplerende video S4. Skalastænger = 100 μm. Farvetasten i bunden hjælper med at identificere musklerne. Forkortelser: FDB, flexor digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, extensor digitorum longus; EHL, extensor hallucis longus; DIC = Differentiel interferenskontrast. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Søjlediagrammer og fusionerede længde- og diameterfordelinger af fibrene opnået ved enzymatisk dissociation af sættet med seks bagbensmuskler i musen. (A) Søjlediagrammer (gennemsnit ± standardafvigelser) og (B) flettede histogrammer bekræfter længdernes forskel, men diametrenes lighed på tværs af alle grupper. *Væsentligt forskellig fra PDQA, PL, EDL, EHL og soleus. **Væsentligt forskellig fra PL, EDL, EHL og soleus. †Væsentligt forskellig fra EDL, EHL og soleus. ††Væsentligt forskellig fra EHL og soleus. ‡Væsentligt forskellig fra soleus. Væsentligt forskellig fra EHL. Farvetasten i bunden hjælper med at identificere musklerne. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Immunofluorescensundersøgelser for fibertypesammensætning af sættet med seks bagbensmuskler i mus. Repræsentative antistofmærkede kryosektioner, der anvendes til analyserne, viser prøvernes gode kvalitet og intakthed. Der er en klar overvejelse af fiber type II i alle muskler, bortset fra soleus, hvor mængden af fiber type I er betydelig. Skalastænger = 100 μm. Farvetasten i bunden hjælper med at identificere musklerne. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Elektroforetisk adskillelse af MHC-isoformer i sættet med seks bagbensmuskler i mus. (A) To repræsentative komplette geler, der køres på forskellige dage med forskellige prøver, viser kvaliteten, renheden og reproducerbarheden af separations- og migrationsafstanden for MHC-isoformerne, når de farves med Coomassie-blå. Selvom disse to billeder blev let redigeret for at øge kontrasten og klarheden for læseren, blev analyserne udført i uredigerede geler. B) Eksempler på analyser af båndene for hver af de seks muskler. Når en ROI er valgt i gelens baner, genereres en plotprofil, og en Gaussisk pasform bruges til at estimere andelen af MHC-isoformer i sættet med seks muskler. Den fundne MHC-sammensætning var: FDB: I 9,0 ± 5,0%, IIa + IIx 91,0 ± 5,0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4%, IIb 74,1 ± 2,4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2%, IIb 75,1 ± 2,2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3%, IIb 78,0 ± 2,3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0%, IIb 72,5 ± 1,0% (n = 3); soleus: I 35,8 ± 2,5%, IIa (+IIx + IIb, når den er til stede) 64,2 ± 2,5% (n = 4). Farvetasten i bunden hjælper med at identificere musklerne. Det grå rektangel under gelen længst til højre i A refererer til molekylvægtmarkøren, der angiver migrationen af IIa til ~ 200 KDa. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MHC = myosin tung kæde; ROI = region af interesse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Video S1: Den beskadigede, bølgede, peroneus longus (PL, venstre) trækker sig ikke sammen ved stimulering, mens den intakte PL (højre) trækker sig godt sammen, selv når den er længere væk fra elektroderne. 0.8x forstørrelse. Stimuleringsprotokollen frigiver rektangulære strømimpulser på 1,2 ms, 0,7 Hz og 50 V gennem to elektroder. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende Video S2: Kontraherende peroneus longus fiber. 20x forstørrelse. Differentiel interferenskontrasttilstand. Stimuleringsprotokollen frigiver rektangulære strømimpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gennem to platinelektroder. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende Video S3: Kontraherende extensor digitorum longus fiber. 20x forstørrelse. Differentiel interferenskontrasttilstand. Stimuleringsprotokollen frigiver rektangulære strømimpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gennem to platinelektroder. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende Video S4: Kontraherende extensor hallucis longus fiber. 20x forstørrelse. Differentiel interferenskontrasttilstand. Stimuleringsprotokollen frigiver rektangulære strømimpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gennem to platinelektroder. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S5. Kontraherende soleus fiber. 20x forstørrelse. Differentiel interferenskontrasttilstand. Stimuleringsprotokollen frigiver rektangulære strømimpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gennem to platinelektroder. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende Video S6: Live optagelse af en Ca2+ transient fra en extensor digitorum longus fiber fyldt med Mag-Fluo-4, AM som beskrevet i trin 4.1.4. Stimuleringsprotokollen frigiver rektangulære strømimpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gennem to platinelektroder. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at supplere de modeller, der er tilgængelige til at studere moden skeletmuskelbiologi, demonstrerer vi her den vellykkede enzymatiske dissociation af en række musemuskler med korte, mellemliggende og lange fibre. Disse fibre muliggør demonstration af generaliserbarheden af MT-II-kinetikken af Ca2+ transienterne i skeletmuskulatur. Endvidere blev fibertyperne i de intakte, hele muskler klassificeret. I betragtning af at FDB er den mest anvendte muskel til fysiologiske eksperimenter, blev de typer fibre, der var til stede i cellesuspensionen efter dissociation, vurderet.

Et batteri af korte, mellemliggende og lange intakte fibre til muskelbiologiske undersøgelser
Dissektionsteknikken, varigheden af den enzymatiske behandling, den anvendte enzymtype og triturationsproceduren er kritiske trin inden for protokollen for at opnå intakte enzymatisk dissocierede fibre. Dissektionen skal udføres så hurtigt som muligt for at reducere tiden under hypoxi og samtidig undgå unødvendig strækning. Sidstnævnte punkt er især relevant for soleus, som ikke må fjernes ved at trække gastrocnemius-soleus-komplekset op. Desuden beskadiger en omfattende enzymatisk behandling (~ 3 h)20,48 og dårlige tritureringsprocedurer (f.eks. Hård, lav erfaring fra forskeren) cellerne, som bekræftet empirisk i flere laboratorier. Collagenase type 2 anbefales over andre collagenase typer. Dannelse af bobler under trituration skal undgås, og enten musklerne eller fibrene må kun manipuleres med glaspipetter i stedet for plastpipettespidser. Brug af hætteglas af glas foretrækkes under hele proceduren frem for plastik, koniske hætteglas, fordi de første giver mere synlighed, kan placeres opad på stereoskopet for en top-view observation af musklen, når de er i opløsningerne, giver mere plads til triturering af musklerne længere og større end FDB og er modstandsdygtige over for ridser forårsaget af glas Pasteur-pipetterne. Da alder, vægt og metabolisk tilstand (f.eks. sund vs. fedtholdig fedme) påvirker metodens effektivitet, kan det være nødvendigt at optimere flere parametre, når man arbejder med dyr uden for det område, der anvendes i dette manuskript. Det er vigtigt, at en mild eksponering af en muskel for visse enzymer som dem, der anvendes her, og en korrekt dissociationsprocedure ikke funktionelt påvirker fibrene, som det fremgår af beviser indsamlet gennem årtier af flere grupper, hvoraf nogle blev opsummeret for et par år siden49. Dette understøttes yderligere af det faktum, at toppen [Ca2+] målt med hurtige Ca2+ farvestoffer under en trækning opnået i manuelt dissekerede bundter og enzymatisk dissocierede fibre fra mus kan betragtes som sammenlignelige (gennemgået i 47).

Selvom der er andre modeller til muskelbiologiske undersøgelser, såsom C2C12 myorør, normale og muterede humane myoblastcellelinjer eller pluripotente stamcellefibre (iPSC) 31,39,50,51,52,53, er de umodne og diskuteres ikke her. Permeabiliserede eller flåede fibre er også informative, velkarakteriserede modeller 54,55, men de er ikke intakte. Modellen af manuelt isolerede fibre giver flere fordele som præsenteret andetsteds20, men har lav effektivitet og kræver høj træning. Disse fakta fremhæver, at modellen af interesse her - fibre opnået ved enzymatisk dissociation - giver mulighed for at opnå intakte, rigelige, modne skeletmuskelfibre af forskellige typer. En begrænsning ved modellen er dog, at manglen på sener begrænser den direkte vurdering af kontraktile egenskaber i de isolerede fibre.

I betragtning af at fibrenes længde ikke er den samme som musklernes længde14,42, og at fibrene er forsøgsenheden, er det mere relevant at klassificere fibrenes længde, ikke musklernes. I betragtning af vores resultater og deres potentielle eksperimentelle implikationer kan FDB-fibrene klassificeres som korte (<1 mm); PDQA og PL som mellemprodukt (1 til 3 mm); og EDL, EHL og soleus så lange (>3 mm). Korte fibre er de nemmeste og mest rigeligt opnåede (~ 400-500 fibre pr. Mus) og er egnede til fluorescensmikroskopieksperimenter, hvor fastgørelsen af fiberen til bundkammeret er nøglen, eller når bevægelsesartefakter skal undgås (f.eks. Ca2+ transienter). Lange fibre er de sværeste at opnå, har den laveste gengivelse og er bedre til proteinekspression ved hjælp af separationsteknikker eller enkeltcellemolekylærbiologiske undersøgelser. Mellemfibre kan opnås i en god mængde (~50 fibre pr. mus) efter moderat træning og er velegnede til mange eksperimentelle tilgange, som vist for eksempel med Ca2+ transienternes eksperimenter. I erkendelse af, at FDB, EDL og soleus er blevet brugt før, er dette det første arbejde, der med succes isolerer fibre fra PDQA-, PL- og EHL-musklerne, hvilket øger tilgængeligheden af modeller til modne skeletmuskelundersøgelser. Desuden sikrer opnåelse af fibre fra forskellige muskler, at der opnås mere information fra det samme dyr, hvilket reducerer eksperimentel variabilitet, øger konklusionernes statistiske kraft og biologiske soliditet og reducerer antallet af dyr, der anvendes til forsøg.

Generaliserbarhed af Ca2+ transienters kinetik
Når vi analyserer kinetikken af Ca2+ transienterne i pattedyrs modne skeletmuskelfibre, har vi tidligere vist, at fibre type I og IIA deler den såkaldte morfologi type I (MT-I), mens fibre IIX og IIB deler MT-II morfologien. MT-II-signaler har typisk en RT på mindre end 1,2 ms, DT på mindre end 25 ms, A1 højere end 30%, [Ca2+] over 15 μM og findes let i FDB- og EDL-fibre33,47. Efter at have sammenlignet resultaterne af de nye Ca2+ transienter af PDQA, PL og EHL med dem, der findes her, og dem, der tidligere er offentliggjort for FDB og EDL, er det ligetil at konkludere, at de også alle er MT-II. En yderligere interessant observation er, at øget tilgængelighed af nye muskler beriget med fibre type IIX og IIB som modeller til opnåelse af dissocierede fibre gør det muligt at bekræfte, at kinetikken af Ca2+ transienterne kan være generaliserede type IIX og IIB fibre har MT-II uanset deres kilde (dvs. flexorer (FDB), ekstensorer (EDL og EHL), eller peronei (PDQA og PL)). Dette styrker ideen om et etableret gencellulært program eller profil af ECC-maskineriet, som er ret ens inden for alle fibre af samme type, og at forskelle i det molekylære maskineri (dvs. isoformer og proteinmængde), der ligger til grund for dannelsen af Ca2+ transienter, forklarer forskellene i morfologier rapporteret blandt fibre33. Endelig er en praktisk implikation, at ved at optage med Mag-Fluo-4 Ca2+ forbigående af en fiber, er det muligt pålideligt at kende dens type.

MHC-ekspression i muskler og isolerede fibre: konsekvenser for typer fibre, der anvendes i fysiologiske eksperimenter
At kende typen af fiber øger pålideligheden af muskelforskning. For eksempel i knockout-mus af ethvert protein, der udtrykkes forskelligt efter fibertyper, kan brug af fibre fra FDB uden nogen typning føre til vildledende resultater. Vores data bekræfter, at FDB er en blandet muskel med en overvægt af type IIX-fibre, i overensstemmelse med tidligere papirer 25,31,56. Endnu vigtigere var der en høj overensstemmelse mellem andelen af fibertyper, der var til stede i hele musklen, og den, der blev opnået efter dissociation. Da disse oplysninger er nye og normalt ikke diskuteres i papirer, der bruger FDB-fibre, kan det spekuleres i, at mange resultater opnået i dissocierede FDB-fibre ved en tilfældighed virkelig kan afspejle blandet information på ~ 20-25%, der kommer fra fibre type I og 75-80% fra type II. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af FDB-muskler bør præsentere data og deres tilsvarende diskussion i forhold til fibertyper.

Da soleus er stærkt beriget med oxidative type I-, IIA- og I / IIA-fibre57,58,59, er disse fibre, der findes i suspensionen efter dissociation33. EDL, en anden velkendt muskel, er næsten blottet for type I-fibre57,58,59, hvilket kun giver hurtige fibre efter dissociation33. Efter samme logik og ifølge de typningsresultater, der viser berigelse af type II-fibre i de tre nye muskler, yderligere understøttet af det faktum, at de få type I-fibre, der findes i peronei-muskler hos mus, er centrale60 og ikke forventes at blive nået under en mild dissociation, antager vi, at sandsynligheden for at anvende en hurtig IIX- eller IIB-fiber i et eksperiment med dissocierede fibre af PDQA, PL eller EHL kan være så høj som 80-90%. Dette synes at være sandt ifølge Ca2+ transienternes data, hvor der ikke blev fundet MT-I-signaler. I betragtning af deres størrelse tilbyder disse fibre fordelen ved at være egnede til at skrive efter afslutningen af et funktionelt eksperiment. Endvidere hjælper BTS's specificitet for MHC II med at diskriminere mellem fibertyper, samtidig med at bevægelsesartefakter fjernes. Endelig, mens denne fibertypemetode var mere besværlig end for nylig beskrevet optimerede 61,62, påvirkede den ikke resultaterne af det nuværende arbejde.

Konklusioner
De præsenterede metodologiske detaljer kan fremme brugen af en række enzymatisk dissocierede muskelfibre i studiet af muskelbiologi. Modellens alsidighed understøttes af muligheden for at få fibre inden for et stort udvalg af længder og typer og deres anvendelse på tværs af flere eksperimentelle applikationer. Udover FDB, EDL og soleus, hvis dissociation blev rapporteret for mange år siden, demonstrerede vi muligheden for at opnå mellemliggende og lange fibre fra andre muskler som PDQA, PL og EHL. I betragtning af den lethed, hvormed dissektionen kan udføres, og antallet af fibre, der kan opnås, samt fibrenes homogenitet og størrelse, foreslår vi PL som en rutinemæssig, passende model til modne skeletmuskelundersøgelser. Dette understøttes af vores resultater om, at kinetikken af Ca2+ transienterne i skeletmuskulaturen kan generaliseres uanset deres kilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne udtrykker deres taknemmelighed til professor Robinson Ramírez fra UdeA for hjælp med dyr og nogle fotos og til Carolina Palacios for teknisk support. Johan Pineda fra Kaika hjalp os med at opsætte farve- og fluorescenskameraerne. Shyuan Ngo fra University of Queensland læste venligst korrektur på manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af CODI-UdeA (2020-34909 fra 22. februarnd, 2021 og 2021-40170 fra 31. martsst, 2022, SIU) og Planning Office-UdeA (E01708-K og ES03180101), Medellín, Colombia, til JCC. Funders deltog ikke i dataindsamling og analyse, manuskriptskrivning eller indsendelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260 (2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14 (2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939 (2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898 (2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976 (2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118 (2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199 (2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807 (2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074 (2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961 (2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669 (2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796 (2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654 (2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126 (2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075 (2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Tags

Biologi udgave 202 skeletmuskulatur muskelfibre fibertyper Ca2+ excitations-kontraktionskobling immunofluorescens myosin tung kæde
Intakte korte, mellemliggende og lange skeletmuskelfibre opnået ved enzymatisk dissociation af seks bagbensmuskler hos mus: ud over flexor digitorum brevis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter