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Biology

बरकरार छोटे, मध्यवर्ती, और लंबे कंकाल की मांसपेशी फाइबर चूहों की छह हिंदलिंब मांसपेशियों के एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त किया जाता है: फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस से परे

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

हम वयस्क चूहों की छह मांसपेशियों से विभिन्न लंबाई और प्रकार के एंजाइमेटिक रूप से अलग फाइबर प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं: उनमें से तीन पहले से ही वर्णित हैं (फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस, एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस, एकमात्र) और उनमें से तीन पहली बार सफलतापूर्वक अलग हो गए (एक्सटेंसर हेलुसिस लॉन्गस, पेरोनस लॉन्गस, पेरोनस डिजिटी क्वार्टी)।

Abstract

माउस मांसपेशियों के एंजाइमी पृथक्करण द्वारा प्राप्त कंकाल मांसपेशी फाइबर शारीरिक प्रयोगों के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं। हालांकि, अधिकांश कागजात फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) के छोटे तंतुओं से निपटते हैं, जो फाइबर प्रकारों से निपटने के परिणामों के दायरे को रोकता है, उपलब्ध जैविक सामग्री की मात्रा को सीमित करता है, और सेलुलर शारीरिक घटनाओं और पिछले जैव रासायनिक और गतिशील ज्ञान के बीच एक स्पष्ट संबंध को बाधित करता है।

यह पत्र वर्णन करता है कि विभिन्न फाइबर प्रकार प्रोफाइल और लंबाई के साथ छह मांसपेशियों से बरकरार फाइबर कैसे प्राप्त करें। C57BL/6 वयस्क चूहों का उपयोग करते हुए, हम मांसपेशियों के विच्छेदन और फाइबर अलगाव प्रोटोकॉल दिखाते हैं और सीए2+ क्षणिक अध्ययन और उनके मॉर्फोमेट्रिक लक्षण वर्णन के लिए तंतुओं की उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं। मांसपेशियों की फाइबर प्रकार संरचना भी प्रस्तुत की जाती है। जब अलग किया जाता है, तो सभी मांसपेशियों को बरकरार रखा जाता है, जीवित फाइबर जो 24 घंटे से अधिक के लिए तेज अनुबंध करते हैं। एफडीबी ने शॉर्ट (<1 मिमी), पेरोनस डिजिटी क्वार्टी (पीडीक्यूए) और पेरोनस लॉन्गस (पीएल) ने मध्यवर्ती (1-3 मिमी) दिया, जबकि एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), एक्सटेंसर हेलुसिस लॉन्गस (ईएचएल), और एकमात्र मांसपेशियों ने लंबे (3-6 मिमी) फाइबर जारी किए।

जब फास्ट डाई मैग-फ्लो -4 के साथ रिकॉर्ड किया जाता है, तो पीडीक्यूए, पीएल और ईएचएल फाइबर के सीए2 + ट्रांजिस्टर ने आकृति विज्ञान प्रकार II (MT-II) की याद ताजा करने वाले तेज, संकीर्ण कैनेटीक्स को दिखाया, जिसे टाइप IIX और IIB फाइबर के अनुरूप जाना जाता है। यह इस तथ्य के अनुरूप है कि इन मांसपेशियों में एफडीबी (~ 80%) और एकमात्र (~ 65%) की तुलना में 90% से अधिक प्रकार II फाइबर हैं। एफडीबी से आगे बढ़ते हुए, हम पहली बार कई मांसपेशियों के पृथक्करण को प्रदर्शित करते हैं, जो 1 और 6 मिमी के बीच लंबाई की एक सीमा तक फैले तंतुओं को प्रस्तुत करते हैं। ये फाइबर व्यवहार्य हैं और तेजी से सीए2+ ट्रांजिस्टर देते हैं, यह दर्शाता है कि एमटी-द्वितीय को आईआईएक्स और आईआईबी फास्ट फाइबर के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, चाहे उनकी मांसपेशी स्रोत कुछ भी हो। ये परिणाम परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों के अध्ययन के लिए मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि करते हैं।

Introduction

स्तनधारियों की परिपक्व कंकाल की मांसपेशी एक बहुक्रियाशील ऊतक है। यह भारी चयापचय को नियंत्रित करता है, गर्मी उत्पादन का मुख्य स्रोत है, और इसके गतिशील गुण श्वसन, शरीर के खंडों की गति, या एक बिंदु से दूसरे 1,2,3 तक विस्थापन में महत्वपूर्ण भूमिका प्रदान करते हैं। कंकाल की मांसपेशी कई बीमारियों के पैथोफिज़ियोलॉजी के लिए भी प्रासंगिक है, जिसमें विरासत में मिली और पुरानी स्थितियां, जैसे कि मायोपैथिस, डिस्ट्रोफी, या सरकोपेनिया, साथ ही कई गैर-मांसपेशियों की पुरानी स्थितियां, जैसे कार्डियोमेटाबोलिक रोग 3,4,5,6,7,8.

स्वास्थ्य और रोग के संदर्भ में परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों का पूर्व विवो अध्ययन मुख्य रूप से दो प्रयोगात्मक मॉडल के माध्यम से संभव हुआ है: पूरी मांसपेशी और पृथक फाइबर। 20वीं शताब्दी में, शोधकर्ताओं ने मोटर इकाइयों, फाइबर प्रकार, और गतिशील गुणों जैसे बल और संकुचन और विश्राम के कैनेटीक्स 9,10,11,12,13,14,15,16. हालांकि, अधिक परिष्कृत कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के आगमन ने क्षेत्र को एकल मांसपेशी फाइबर के अध्ययन की ओर स्थानांतरित कर दिया। अग्रणी काम तो बरकरार फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) बाद के लक्षण वर्णन 17,18,19 के लिए एंजाइमी पृथक्करण द्वारा चूहों के फाइबर के अलगाव सक्षम. हालांकि एफडीबी फाइबर भी मैनुअल विच्छेदन20 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, आसानी और murine मांसपेशियों के एंजाइमी पृथक्करण के उच्च throughpot, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की एक किस्म के लिए उनकी उपयुक्तता के अलावा, व्यापक रूप से पिछले दो दशकों के दौरान बाद मॉडल इस्तेमाल किया है.

लघु एफडीबी फाइबर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और अन्य बायोफिजिकल अध्ययन, जैव रासायनिक, चयापचय, और औषधीय विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों, कोशिका जीव विज्ञान दृष्टिकोण के लिए अभिकर्मक, या मायोजेनेसिसअध्ययन 5,21,22,23,24,25,26,27,28 में स्टेम कोशिकाओं के स्रोत के रूप में उपयुक्त हैं, 29,30,31,32. हालांकि, मांसपेशियों के प्रयोगों में केवल एफडीबी फाइबर का उपयोग फाइबर प्रकारों से निपटने वाले अनुसंधान के दायरे को कम करता है और कुछ पद्धति तकनीकों के लिए या एक जानवर से अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए उपलब्ध जैविक सामग्री की मात्रा को सीमित करता है। ये सीमाएं अलग-अलग पूरे, बरकरार, मांसपेशियों (जैसे, ईडीएल, एकमात्र, पेरोनी) में किए गए पिछले जैव रासायनिक और गतिशील अध्ययनों के साथ सेलुलर शारीरिक घटनाओं के स्पष्ट सहसंबंध में बाधा डालती हैं।

इन सीमाओं पर काबू पाने, कुछ समूहों लंबे समय तक ईडीएल और एकमात्र मांसपेशियों 24,33,34,35,36,37,38,39,40 को अलग करने में सफल रहे, अन्य प्रासंगिक मांसपेशियों के लिए विधि को और विस्तारित करने के लिए दरवाजा खोलना। हालांकि, ईडीएल और एकमात्र फाइबर का उपयोग अभी भी दुर्लभ है, संभवतः उन्हें बरकरार फाइबर के रूप में प्राप्त करने के लिए पद्धतिगत विवरण की कमी के कारण। यहां, हम विस्तार से वर्णन करते हैं कि छह मांसपेशियों से विभिन्न लंबाई और प्रकारों के तंतुओं को कैसे अलग किया जाए: उनमें से तीन पहले से ही वर्णित हैं (एफडीबी, ईडीएल, और एकमात्र) और उनमें से तीन पहली बार सफलतापूर्वक अलग हो गए (एक्सटेंसर हेलुसिस लॉन्गस [ईएचएल], पेरोनस लॉन्गस [पीएल], और पेरोनस डिजिटी क्वार्टी [पीडीक्यूए])। वर्तमान कार्य के परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि एंजाइमेटिक रूप से अलग किए गए फाइबर का मॉडल पहले प्रकाशित आंकड़ों के साथ अध्ययन और भविष्य के सहसंबंधों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है, इस प्रकार परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों के अध्ययन के लिए मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि होती है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को एंटिओक्विया विश्वविद्यालय (UdeA) के जानवरों के साथ प्रयोगों में नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (104जून, 21 के मिनट 2016, और 005 अप्रैल 15, 2021 के), 84 के कानून 1989 और 8430 के संकल्प 1993 के अनुसार कोलंबियाई सरकार द्वारा जारी किया गया और पशु अनुसंधान के अनुपालन में प्रदर्शन और रिपोर्ट किया गया: 41 वीवो एक्सपेरिमेंट्स (अराइव) दिशानिर्देशों में रिपोर्टिंग। यहां प्रस्तुत सभी परिणाम स्वस्थ, 7-13 सप्ताह पुराने, 20-26 ग्राम, C57BL/6 नर चूहों से आते हैं। चित्रा 1 इस अध्ययन के सामान्य डिजाइन और प्रक्रियाओं के क्रम को दर्शाता है। सभी अभिकर्मकों, सामग्रियों और उपकरणों के विवरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

1. पशु

  1. नियंत्रित तापमान (21 ± 2 डिग्री सेल्सियस) और प्रकाश: अंधेरे (12:12 एच) चक्रों की शर्तों के तहत, लकड़ी से व्युत्पन्न बिस्तर के साथ ऐक्रेलिक, पारदर्शी, आयताकार पिंजरे प्रति अधिकतम छह चूहों को घर दें।
  2. जानवरों को बिना किसी पर्यावरणीय संवर्धन के विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त पशु सुविधाओं में भोजन और नल के पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान करें।

2. विच्छेदन

  1. समाधान, सामग्री और अभिकर्मक
    1. निम्नलिखित संरचना (एमएम में सभी सांद्रता) के साथ काम कर रहे समाधान तैयार करें और फ़िल्टर करें (0.22 माइक्रोन):
      1. टायरोड: 5.4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, pH 7.3
      2. पृथक्करण: 2.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 0.5 MgCl2, 138 NaCl, 0.1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7.4
      3. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस): 137 NaCl, 8.6 Na2HPO4, 2.8 KH2PO4, pH 7.34
    2. दो विच्छेदन कक्षों तैयार करें; स्टीरियोस्कोप; ऑपरेटिंग कैंची; ठीक कैंची; ठीक संदंश; और साफ, पारदर्शी, गैर-शंकु, 1-1.5 सेमी चौड़ा, कैप के साथ 3-4 एमएल कुल मात्रा की कांच की शीशियां। विद्युत विच्छेदन कक्षों में मांसपेशियों उत्तेजक के लिए एक प्रणाली की व्यवस्था.
    3. विभिन्न चौड़ाई युक्तियों के फायर-पॉलिश पाश्चर ग्लास पिपेट तैयार करें: 5, 4, 3, 2, और 1 मिमी।
    4. पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। कोलेजनेज प्रकार 2 के 3 मिलीग्राम के विभाज्य वजन.
  2. प्रक्रिया
    1. स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित विधियों का उपयोग करके माउस का बलिदान करें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह तेजी से, कम तनावपूर्ण है, और दवाओं के संपर्क से बचा जाता है, जो मांसपेशियों के ऊतकों (जैसे सीओ2 या कुछ एनेस्थेटिक्स) को प्रभावित कर सकता है। बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए तुरंत विच्छेदन शुरू करें।
    2. माउस को फोम की सतह पर रखें और अग्रभाग को टेप या पिन करें। ऑपरेटिंग कैंची के साथ घुटनों पर दोनों hindlimbs कटौती, एक अलग विच्छेदन कक्ष में उनमें से प्रत्येक हस्तांतरण, और ऊतक को कवर करने के लिए ठंड (10-20 डिग्री सेल्सियस) टायरोड जोड़ने.
      नोट: प्रत्येक हिंडलिंब निम्नलिखित क्रम में छह अलग-अलग मांसपेशियां देगा: एफडीबी, एकमात्र, ईडीएल, ईएचएल, पीएल और पीडीक्यूए। कण्डरा से कण्डरा तक बरकरार छह मांसपेशियों को विच्छेदन करने के लिए विस्तृत शारीरिक संदर्भ चित्रा 2 औरकहीं और 42 में दिए गए हैं।
    3. विच्छेदन कक्ष में पहली हिंडलिंब को एक स्थिति में पिन करें जिसमें पैरों का पिछला चेहरा दिखाई देता है। आवर्धन के तहत त्वचा को हटा दें; फिर एफडीबी (चित्रा 2) को बेनकाब करें और हटा दें। टायरोड समाधान के 1 एमएल के साथ एक लेबल ग्लास शीशी में यह स्टोर.
      नोट: मांसपेशियों के ऊतकों में किसी भी अवांछित कटौती से बचने के लिए उपयुक्त आवर्धन और पिछले प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।
    4. उजागर करें, निकालें, और टायरोड के 1 एमएल के साथ एक अलग शीशी में एकमात्र स्टोर करें। पहले गैस्ट्रोकनेमियस को अलग करने के लिए और फिर एकमात्र को हटाने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है।
    5. पैर के पूर्वकाल चेहरे को बेनकाब करें, त्वचा को हटा दें, और टखने में टिबिअलिस पूर्वकाल और ईडीएल मांसपेशियों के डिस्टल टेंडन की पहचान करें। टिबियलिस को निकालें और त्यागें; फिर ईडीएल (चित्रा 2) के बाहर का टेंडन काट लें। ईडीएल को हटाने तक विच्छेदन जारी रखें और इसे टायरोड के 1 एमएल के साथ एक अलग ग्लास शीशी में रखें।
    6. ईएचएल मांसपेशी को हटा दें, जो ईडीएल के ठीक पीछे और औसत दर्जे का है। 1अंक के लिए कण्डरा की पहचान और अनुसरण करके विच्छेदन शुरू करें, जैसा कि चित्रा 2 के संबंधित पैनल में दर्शाया गया है। टायरोड के 1 एमएल के साथ एक अलग कांच की शीशी में मांसपेशियों को रखें।
    7. इसे काटने और पीएल मांसपेशी (चित्रा 2) को हटाने के लिए पेरोनी के सबसे बाहरी कण्डरा को पहचानें और उसका पालन करें। टायरोड के 1 एमएल के साथ एक अलग कांच की शीशी में मांसपेशियों को रखें।
    8. 4वें अंक तक कण्डरा को पहचानें और उसका पालन करें; इसे काटें और पीडीक्यूए मांसपेशी (चित्रा 2) को हटा दें। टायरोड के 1 एमएल के साथ एक अलग कांच की शीशी में रखें.
    9. दूसरे हिंदलिंब के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।
    10. एक लेबल ग्लास शीशी या टायरोड समाधान के साथ एक छोटे पेट्री डिश में एक ही प्रकार की दोनों मांसपेशियों को इकट्ठा करें।
      नोट: यदि एक कामकाजी सत्र के दौरान मांसपेशियों के दो से अधिक जोड़े विच्छेदन करने की योजना बनाई गई है, तो विच्छेदन प्रक्रिया के लिए दो शोधकर्ताओं की भर्ती करें।

3. मांसपेशी फाइबर अलगाव प्रोटोकॉल

  1. मलबे और माउस फर को हटाने के लिए विच्छेदन कक्षों में टायरोड समाधान को नवीनीकृत करें। एफडीबी मांसपेशियों को एक विच्छेदन कक्ष में डालें, उनकी अखंडता को सत्यापित करें, और उन्हें 1 एमएल पृथक्करण समाधान के साथ एक नई कांच की शीशी में स्थानांतरित करें। इस प्रक्रिया को ईएचएल, पीएल और पीडीक्यूए मांसपेशियों के साथ दोहराएं।
    नोट: यदि कोई मांसपेशी हाइपरकॉन्ट्रैक्टेड, कट या विद्युत उत्तेजना के प्रति अनुत्तरदायी दिखती है, तो अगले प्रोटोकॉल चरण पर जारी न रखें। इसके बजाय, समाधान (पीएच, संदूषण, परासरण) की गुणवत्ता की पुष्टि करके और अधिक विच्छेदन कौशल (चित्रा 1सी और पूरक वीडियो एस 1) प्राप्त करके विच्छेदन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करें।
  2. तंतुओं के उन्मुखीकरण के बाद, एकमात्र और ईडीएल मांसपेशियों के लिए अनुदैर्ध्य या विकर्ण कटौती करें(चित्र 2)। एकमात्र के लिए, केंद्रीय कण्डरा का पालन करें, इसकी लंबाई का ~ 80% काट लें। ईडीएल के लिए, बस एक या दो टेंडन का पालन करें और एकमात्र के लिए समान लंबाई में कटौती करें। हदबंदी समाधान के 1 एमएल के साथ कांच की शीशियों में मांसपेशियों की प्रत्येक जोड़ी रखो।
    नोट: यह प्रक्रिया ईडीएल और एकमात्र को छोटा बनाती है और कोलेजन को ऊतक में बेहतर प्रवेश करने की अनुमति देती है। पर्याप्त बढ़ाई (40-50x), साथ ही ठीक कैंची और संदंश, अनिवार्य हैं. हदबंदी प्रोटोकॉल के अगले चरण को जारी रखने से पहले हमेशा दृश्य निरीक्षण और विद्युत उत्तेजना द्वारा नमूना अखंडता की जांच करें।
  3. प्रत्येक शीशी में 3 मिलीग्राम कोलेजन टाइप 2 (250-300 यू/एमजी की गतिविधि के साथ) जोड़ें जिसमें 1 एमएल पृथक्करण समाधान और मांसपेशियों की एक जोड़ी होती है। उपयोग किए गए एंजाइम बैच की गतिविधि पर विचार करके कोलेजन की सटीक मात्रा को मानकीकृत करें।
  4. कोमल झटकों के साथ, 36.8-37 डिग्री सेल्सियस पर 65-90 मिनट के लिए पानी के स्नान में मांसपेशियों के जोड़े को इनक्यूबेट करें।
    नोट: तापमान नियंत्रण के साथ कठोर रहें। प्रक्रिया को मानकीकृत करें ताकि मांसपेशियों को नुकसान से बचने के लिए 100 मिनट से अधिक समय तक कोलेजन में न रहें।
  5. इनक्यूबेशन के 65वें मिनट के बाद हर 5 मिनट में स्टीरियोस्कोप आवर्धन के तहत शीशियों की जांच करें। जब मांसपेशियां थोड़ी लहरदार, रैग्ड और ढीली दिखती हैं, तो धीरे से शीशी को हिलाएं और सत्यापित करें कि क्या कुछ फाइबर आसानी से अलग होने लगते हैं। यदि यह मामला है, तो कोलेजन को निष्क्रिय करने और हटाने के लिए कमरे के तापमान पर टायरोड के साथ मांसपेशियों को धो लें।
    नोट: पिपेट के साथ मांसपेशियों को छूने के बिना, धुलाई सावधानी से की जानी चाहिए। टायरोड के 0.8 एमएल जोड़कर शुरू करें और फिर समाधान के 0.8 एमएल को हटा दें। इस प्रक्रिया को 4-5x दोहराएं और सत्यापित करें कि समाधान पूरी तरह से पारदर्शी हो जाता है।
  6. आग-पॉलिश पाश्चर पिपेट के सेट की मदद से टायरोड में बहुत कोमल विचूर्णन के साथ मांसपेशियों के थोक से अधिक फाइबर अलग करें। व्यापक विंदुक (5 मिमी टिप) के साथ मांसपेशियों के चारों ओर समाधान आंदोलन से शुरू करें और फिर धीरे से विंदुक 3-4x में और बाहर मांसपेशियों को खींचें। जब मांसपेशी फाइबर जारी करने शुरू होता है और पतला हो जाता है, अगले विंदुक (4 मिमी टिप) के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ.
    नोट: इस प्रक्रिया के माध्यम से प्रदान किए गए फाइबर उत्तेजित रहते हैं और 24 घंटे से अधिक के लिए तेज अनुबंध करते हैं, जैसा कि पूरक वीडियो एस 2, पूरक वीडियो एस 3, पूरक वीडियो एस 4 और पूरक वीडियो एस 5 में पीएल, ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र फाइबर का उपयोग करके उदाहरण दिया गया है।

4. प्रायोगिक प्रक्रियाएं

नोट: पृथक फाइबर sarcoplasmic सीए2 + एकाग्रता अनुमान, morphometric माप, और मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया.

  1. सार्कोप्लाज्मिक सीए का मापन2+ एक चिकोटी के दौरान एकाग्रता
    1. प्रयोगात्मक स्नान कक्ष पर एक साफ, कांच स्लाइड माउंट. लैमिनिन के 2-3 माइक्रोन के साथ स्लाइड को कोट करें और स्लाइड पर फाइबर निलंबन के ~ 400 माइक्रोन डालने से पहले इसे 30 एस के लिए सूखने दें। तंतुओं कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए लेमिनिन का पालन करने के लिए अनुमति दें.
    2. एपिफ्लोरेसेंस (चित्रा 3 ए) के लिए सुसज्जित एक उल्टे माइक्रोस्कोप के मंच पर प्रयोगात्मक कक्ष माउंट करें।
    3. प्रयोगात्मक कक्ष के दोनों ओर रखे गए दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से आयताकार वर्तमान दालों (0.8-1.2 एमएस) को लागू करके तंतुओं की व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए एकल चिकोटी पैदा करें। यहां तक कि जब लैमिनिन से जुड़ा होता है, तो तंतुओं का संकुचन अभी भी मुख्य रूप से चरम सीमाओं पर दिखाई देता है।
    4. टायरोड समाधान में 4-5 मिनट के लिए तेजी से सीए2+ डाई मैग-फ्लो -4, एएम के 3.5-4.5 माइक्रोन के साथ फाइबर लोड करें। इस समय के बाद, बाह्य डाई को हटाने के लिए धीरे से टायरोड से धो लें। इंट्रासेल्युलर डाई को अंधेरे परिस्थितियों में ~ 15-20 मिनट के लिए डी-एस्टरीकृत होने की अनुमति दें। डाई कम्पार्टमेंटलाइजेशन से बचने के लिए तापमान को हमेशा 22 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखें।
      नोट: केवल डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में मैग-फ्लूओ -4, एएम का स्टॉक तैयार करें, ताकि लोडिंग टायरोड समाधान में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.5% से कम हो।
    5. एक सफेद प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) और उत्तेजना/डाइक्रोइक/उत्सर्जन के लिए निम्नलिखित तरंग दैर्ध्य के साथ एक फिल्टर सेट के साथ फाइबर को रोशन करें: 450-490/510/515 एनएम(चित्रा 3ए)।
      नोट: उत्तेजना के वैकल्पिक स्रोतों में पारा और क्सीनन प्रतिदीप्ति लैंप शामिल हैं। डाई के फोटोब्लीचिंग और सेल को नुकसान से बचने के लिए उत्तेजना स्थान की सबसे कम संभव तीव्रता और आकार का उपयोग करें।
    6. 20-22 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक कक्ष के दोनों ओर रखे गए दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से आयताकार वर्तमान दालों (0.8-1.2 एमएस) को लागू करके फाइबर की सीए2+ प्रतिक्रिया (सार्कोप्लाज्मिक सीए2+ ट्रांजिस्टर) को विकसित करें।
    7. लीजिए और प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त एक तेल विसर्जन 40x लंबी दूरी के उद्देश्य और एक डिजिटाइज़र (चित्रा 3 ए और पूरक वीडियो एस 6) से जुड़े एक फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) के साथ प्रकाश संकेतों को बचाएं। 0-200 मनमाना इकाइयों (एयू) के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में एक पैमाने सुनिश्चित करें और उत्तेजना स्पॉट के आकार और पीएमटी के लाभ को संशोधित करके उस पैमाने पर 10 एयू के लिए प्रयोग के आराम प्रतिदीप्ति (एफआराम) सेट करें। एक बार प्रक्रिया मानकीकृत है, दूसरे करने के लिए एक प्रयोग से लाभ unmodified रखने के लिए और केवल स्पॉट आकार में मामूली समायोजन के माध्यम से पैमाने सेट.
      नोट: यदि आंदोलन कलाकृतियां उत्पन्न होती हैं, तो टायरोड समाधान में 20-30 माइक्रोन एन-बेंज़िल-पी-टोल्यूनि सल्फोनामाइड (बीटीएस) का उपयोग करें।
    8. निम्नानुसार संकेतों का विश्लेषण और जांच करें:
      1. लोपास 1 kHz पर पूरे ट्रेस को फ़िल्टर करता है।
      2. ट्रेस के 1 एस में एफबाकी की गणना करें, एफबाकी को 0 पर समायोजित करें, और पीक सार्कोप्लाज्मिक सीए2+ यात्रियों के आयाम (एफपीक) को मापें। आयाम को समीकरण (1) के रूप में प्रस्तुत करें:
        Equation 1(1)
      3. शिखर सीए2+ एकाग्रता ([सीए2+], माइक्रोन) समीकरण (2)26 और निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग कर गणना: स्वस्थानी पृथक्करण स्थिरांक (केडी) = 1.65 × 105 माइक्रोन2 में, अधिकतम प्रतिदीप्ति (एफअधिकतम) 150.9 एयू की, न्यूनतम प्रतिदीप्ति (एफमिनट) 0.14 एयू की, मैग-फ्लो -4 एकाग्रता [डी] टी 229.1 माइक्रोन26. एफशिखर पहले से ही चरण 4.1.8.2 में प्राप्त किया गया था।
        Equation 2(2)
      4. आयाम (आरटी, एमएस) के 10% से 90% तक वृद्धि के समय को मापें, आधे अधिकतम (एचडब्ल्यू, एमएस) पर अवधि, और आयाम के 90% से 10% तक क्षय समय (डीटी, एमएस)। फिर, द्विघातीय फ़ंक्शन (समीकरण 3) के साथ फिट के अनुसार क्षय कैनेटीक्स का अनुमान लगाएं:
        Equation 3(3)
      5. क्षय τ1 तथा τ2 (उे) तथा आयाम ं1 तथा ं226 के समय स्थिरांक के मान सहेजें।
  2. मॉर्फोमेट्रिक माप
    1. प्रयोगात्मक स्नान कक्ष पर एक साफ, कांच स्लाइड माउंट. लैमिनिन के 2-3 माइक्रोन के साथ स्लाइड को कोट करें और स्लाइड पर फाइबर निलंबन के ~ 400 माइक्रोन डालने से पहले इसे 30 एस के लिए सूखने दें। तंतुओं कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए लेमिनिन का पालन करने के लिए अनुमति दें.
    2. प्रयोगात्मक कक्ष के दोनों ओर रखे गए दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से आयताकार वर्तमान दालों (0.8-1.2 एमएस) को लागू करके तंतुओं की व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए एकल चिकोटी पैदा करें। यहां तक कि जब लैमिनिन से जुड़ा होता है, तो तंतुओं का संकुचन अभी भी मुख्य रूप से चरम सीमाओं पर दिखाई देता है।
    3. 10x और 20x उद्देश्यों का उपयोग करके जीवित तंतुओं की छवियां प्राप्त करें और कम से कम 5 मेगापिक्सेल का कैमरा एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार है। छवियों को स्टोर करें। ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए TIFF प्रारूप।
      नोट: ~ 2-6 छवियों का एक सेट पूरी तरह से एक लंबे फाइबर पर कब्जा करने की जरूरत हो सकती है.
    4. एक ही आवर्धन के तहत एक माइक्रोस्कोप माइक्रोमीटर अंशांकन शासक छवि। छवियों को स्टोर करें। ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए TIFF प्रारूप।
    5. छवि विश्लेषण के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर के अंशांकन उपकरण का उपयोग करके तंतुओं की लंबाई और व्यास को निम्नानुसार मापें:
      1. पूरक चित्रा एस 1 में दिखाए गए विश्लेषण/सेट स्केल टूल का उपयोग करके माइक्रोस्कोप माइक्रोमीटर अंशांकन शासक की मदद से छवियों में पिक्सेल और ज्ञात दूरी (माइक्रोन) के बीच संबंध स्थापित करें।
      2. फाइबर के साथ 2-6 अलग-अलग स्थानों में फाइबर और व्यास के एक टिप से दूसरे तक एक बार लंबाई मापें (प्रति छवि 1-2 माप, इसकी लंबाई के आधार पर), पूरक चित्रा एस 1 के रूप में।
      3. लंबाई (माइक्रोन या मिमी) के मूल्य और फाइबर प्रति मापा सभी व्यास (माइक्रोन) के औसत की रिपोर्ट करें।
  3. मायोसिन भारी श्रृंखला अभिव्यक्ति अध्ययन
    नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस43 और सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज)33,44,45,46 द्वारा एमएचसी के निर्धारण के बारे में विवरण के लिए, कृपया पूरक फ़ाइल 1 देखें। एफडीबी-पृथक फाइबर के निलंबन में एमएचसी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस निर्धारण द्वारा फाइबर टाइपिंग के लिए प्रोटोकॉल निम्नानुसार है:
    1. लेमिनिन के 2-3 माइक्रोन के साथ पांच साफ, ग्लास स्लाइड में से प्रत्येक को कोट करें और प्रत्येक स्लाइड पर फाइबर निलंबन के ~ 300 माइक्रोन डालने से पहले इसे 30 एस के लिए सूखने दें। तंतुओं को कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए लेमिनिन का पालन करने दें।
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए फ्रीजर ठंडा एसीटोन के साथ तैयारी को ठीक करें।
    3. पीबीएस के साथ धीरे 3x धो लें.
    4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.7% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पूरक पीबीएस के साथ कोशिका झिल्ली पारगम्य करें।
    5. 0.2% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) और 0.04% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पूरक पीबीएस के साथ धीरे से 3x धोएं, और बाद में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2% बीएसए, 2% बकरी सीरम और 0.4% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पीबीएस के साथ ब्लॉक करें।
    6. पीबीएस के साथ धीरे से 3x धोएं 0.2% बीएसए और 0.04% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पूरक और निम्नानुसार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं:
      1. 1% बीएसए और 0.04% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पीबीएस में एक अलग शीशी में प्रत्येक एंटी-एमएचसी प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें: एंटी-आई (1: 1,500), एंटी-II (1: 600), एंटी-आईआईए (हाइब्रिडोमा से पूरे वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करें), और एंटी-आईआईबी (1: 500)।
      2. प्रत्येक स्लाइड को एक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें और पीबीएस के साथ शेष स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए नियंत्रण के रूप में इनक्यूबेट करें।
        नोट: इस प्रोटोकॉल में, फाइबर प्रकार IIX सभी नमूनों में लेबल नहीं किया गया।
    7. पीबीएस के साथ धीरे से 3x धो लें और कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए एक फ्लोरोसेंट हरे अणु के साथ युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:800) के साथ सभी स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
    8. 15 मिनट के लिए 1 μg/mL Hoechst के साथ दाग नाभिक।
    9. पीबीएस के साथ धीरे से 3x धो लें, ध्यान से बढ़ते माध्यम के 20-40 माइक्रोन जोड़ें, और एक कवरस्लिप रखें।
      नोट: कोमल समाधान एक्सचेंजों और धुलाई सुनिश्चित करें कि फाइबर के दर्जनों स्लाइड से जुड़े रहते हैं, प्रयोग सांख्यिकीय ध्वनि बनाने.
    10. प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त 10x उद्देश्य और उत्तेजना/डाइक्रोइक/उत्सर्जन के लिए निम्नलिखित तरंग दैर्ध्य के साथ एक फिल्टर सेट का उपयोग करके प्रत्येक स्लाइड की कल्पना करें: 450-490/510/515 एनएम और सभी सकारात्मक और नकारात्मक तंतुओं की गणना करें। वैकल्पिक रूप से, एक ही तकनीकी शर्तों और कम से कम 5 मेगापिक्सेल का एक कैमरा एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करें और उन्हें में स्टोर करें। ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए TIFF प्रारूप।
    11. एक डेटाबेस में प्रत्येक स्लाइड के सकारात्मक और नकारात्मक फाइबर रिकॉर्ड और इसी स्लाइड में मौजूद फाइबर की कुल संख्या के आधार पर सकारात्मक I, IIA, IIB, और कुल द्वितीय फाइबर के प्रतिशत की गणना. कुल II फाइबर के प्रतिशत में से IIA+IIB के योग को घटाकर IIX फाइबर के प्रतिशत की गणना कीजिये। 100% के मान से I+II के योग को घटाकर हाइब्रिड I/IIA फाइबर के प्रतिशत का अनुमान लगाएं। अंत में, शुद्ध प्रकार I और II फाइबर रखने के लिए I और II के कुल से संकर कोशिकाओं का प्रतिशत घटाएं।
      नोट: एमएचसी संरचना अध्ययन में, फाइबर प्रकार एक बड़े अक्षर द्वारा नामित कर रहे हैं, जबकि isoforms एक लोअरकेस पत्र46 द्वारा नामित कर रहे हैं.
  4. हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन धुंधला हो जाना
    1. लैमिनिन के 2-3 माइक्रोन के साथ एक साफ, ग्लास स्लाइड को कोट करें और स्लाइड पर फाइबर निलंबन के ~ 300 माइक्रोन डालने से पहले इसे 30 एस के लिए सूखने दें। तंतुओं को कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए लेमिनिन का पालन करने दें।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कार्नॉय के समाधान (60% पूर्ण इथेनॉल, 30% क्लोरोफॉर्म, 10% एसिटिक एसिड) के साथ तैयारी को ठीक करें।
    3. 90 एस के लिए hematoxylin के साथ सेते हैं.
    4. नल के पानी से धीरे से 3x धोएं।
    5. 30 एस के लिए 70% इथेनॉल में तैयार 1% ईोसिन वाई के साथ सेते हैं।
    6. नल के पानी से धीरे से 3x धोएं।
    7. पूर्ण इथेनॉल में 3x विसर्जित करें।
    8. 60 एस के लिए जाइलोल में सेते हैं.
    9. बढ़ते माध्यम के 20-40 माइक्रोन जोड़ें और एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना करें। कम से कम 5 मेगापिक्सेल के रंगीन कैमरे का उपयोग करके वांछित आवर्धन पर चित्र प्राप्त करें।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण और रेखांकन

नोट: प्रयोगात्मक इकाई एक मांसपेशी फाइबर है।

  1. मानक विचलन ± माध्य के रूप में परिणाम व्यक्त करें और कुछ विश्लेषणों के लिए विश्वास अंतराल 95% (CI95%) की गणना करें।
  2. समूहों के बीच लंबाई, व्यास और सीए2+ यात्रियों के कैनेटीक्स की तुलना करने के लिए, बोनफेरोनी के सुधार के साथ विचरण (एनोवा) और पोस्ट-हॉक परीक्षणों का विश्लेषण करें।
  3. क्रमशः शापिरो-विल्क और लेवेन के परीक्षणों का उपयोग करके सामान्यता और विचरण समानता का आकलन करें।
  4. जब p 0.05 < हो तो महत्वपूर्ण अंतर पर विचार करें।

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Representative Results

एक चिकोटी के दौरान Sarcoplasmic Ca2+ एकाग्रता
अलग-अलग फाइबर के सेट में शारीरिक प्रयोगों की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए और उत्तेजना-संकुचन युग्मन (ईसीसी) और फाइबर प्रकारों पर हमारे पिछले निष्कर्षों का विस्तार करने के लिए, सीए2 + यात्रियों को सभी मांसपेशियों से फाइबर में अधिग्रहित किया गया था। सबसे पहले, FDB (n = 5) और EDL (n = 7) ने Ca2+ कैनेटीक्स दिखाया जिसे आकृति विज्ञान प्रकार II (MT-II) के रूप में जाना जाता है। ये तेज, नुकीले संकेत हैं, जिनका आरटी ~ 1 एमएस तक रहता है; इसके क्षय चरण को पूरे आयाम के 30% से बड़ा पहला घटक (ए1) के साथ एक द्विघातीय फ़ंक्शन के साथ लगाया जा सकता है, और इसकी चोटी [सीए2+] 15 और 30 माइक्रोन33,47(चित्रा 3बी)के बीच है। उनके परिणाम तालिका 1 के पहले कॉलम में (एन = 12) जमा किए गए हैं, जबकि एकमात्र सीए2 + यात्रियों (एन = 6) के परिणाम तालिका 1 के दूसरे कॉलम में प्रस्तुत किए गए हैं। एकमात्र संकेतों को आकृति विज्ञान प्रकार I (MT-I, चित्र 3B) -Wide के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जिसमें 1.2 ms से अधिक RT, 30% से कम A1 और 7 और 13 μM33,47 के बीच एक चोटी [Ca2+] थी। इन दो स्तंभों नई मांसपेशियों के सीए2 + यात्रियों की तुलना के लिए संदर्भ के रूप में माना जाता था. चूंकि पीडीक्यूए (एन = 4), पीएल (एन = 6), और ईएचएल (एन = 4) के सभी फाइबर एमटी-द्वितीय(चित्रा 3बी)साझा करते हैं, इसलिए उनके डेटा को तालिका 1 के तीसरे कॉलम में (एन = 14) पूल किया जाता है। इन संकेतों ने ~ 1 एमएस का औसत आरटी, ~ 45% का ए1, 15 माइक्रोन से अधिक एक चोटी [सीए2+] दिखाया, और पहले कॉलम में प्रस्तुत परिणामों के साथ बहुत अच्छी तरह से तुलना करें लेकिन स्पष्ट रूप से उन लोगों से भिन्न हैं दूसरे कॉलम में दिखाया गया है, जैसा कि सांख्यिकीय विश्लेषण (तालिका 1) द्वारा पुष्टि की गई है। पूरे नमूने का सबसे तेज़ संकेत एक ईएचएल फाइबर से आया, जिसमें 0.66 का ΔF/F, 16.99 माइक्रोन का [Ca2+], 0.85 ms का RT, 2.42 ms का HW और 10.56 ms का DT था। τ1 और τ2 क्रमशः 1.63 और 7.21 एमएस थे, जबकि A1 और A2 मान 56.60% और 43.40% थे। सबसे धीमा संकेत एक एकमात्र फाइबर से आया, जिसमें 0.41 का ΔF/F, 9.76 माइक्रोन का [Ca2+], 1.56 ms का RT, 9.43 ms का HW और 31.88 ms का DT था। τ1 और τ2 क्रमशः 2.81 और 96.42 एमएस थे, जबकि A1 और A2 मान क्रमशः 19.55% और 80.45% थे। 

छोटे, मध्यवर्ती और लंबे रेशों की बैटरी
उनके मांसपेशी स्रोत के अनुसार तंतुओं के बीच स्पष्ट अंतर के अवलोकन ने एक अधिक पूर्ण रूपात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम किया। चित्रा 4 के हिस्टोग्राम सभी मांसपेशियों में तंतुओं की लंबाई में हड़ताली बदलाव दिखाते हैं। एफडीबी (227.06 माइक्रोन) से सबसे छोटे फाइबर की तुलना एकमात्र (5.69 मिमी) से सबसे लंबे समय तक करते समय इस पर प्रकाश डाला जाता है। औसत लंबाई मूल्यों को तालिका 2 में संक्षेपित किया गया है। समूहों के बीच महत्वपूर्ण सांख्यिकीय अंतर थे (पृष्ठ < 0.01)। ये परिणाम एफडीबी फाइबर के वर्गीकरण को कम (<1 मिमी) के रूप में अनुमति देते हैं; पीडीक्यूए और पीएल मध्यवर्ती (1 से 3 मिमी) के रूप में; और ईडीएल, ईएचएल, और एकमात्र लंबे समय तक (>3 मिमी) (पूरक चित्रा एस 2)।

इसके विपरीत, सभी मांसपेशियों के तंतुओं के औसत व्यास (तालिका 2) और मूल्यों के वितरण (चित्रा 4) में मामूली अंतर देखे गए। फिर भी, समूहों के बीच महत्वपूर्ण सांख्यिकीय अंतर थे (पृष्ठ < 0.01)। जब विस्तार से मूल्यांकन किया गया, तो एफडीबी और एक दूसरे की मांसपेशियों के बीच और एफडीबी (एफडीबी 38.40 ± 9.40 माइक्रोन, एन = 370) और मध्यवर्ती और लंबे फाइबर के पूल (45.07 ± 9.99 माइक्रोन, एन = 422, पी < 0.05) के बीच अंतर थे। पूरे नमूने की सबसे पतली सेल 18.42 माइक्रोन (एफडीबी) मापा और सबसे मोटी 82.79 माइक्रोन (पीडीक्यूए) तक पहुंच गई।

शारीरिक प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले फाइबर प्रकार
सबसे पहले, प्रत्येक पूरी मांसपेशियों में मौजूद फाइबर प्रकार इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा निर्धारित किए गए थे। एकमात्र को छोड़कर, मांसपेशियों ने टाइप II फाइबर (पूरक चित्रा एस 3, तालिका 3, और तालिका 4) के 76% से अधिक की प्रबलता दिखाई। EHL, PL, और PDQA विशेष रूप से तेज मांसपेशियां हैं, जिनमें 90% से अधिक तेज फाइबर और 58.8% प्रकार के IIB फाइबर हैं, जैसा कि PDQA में पाया जाता है। ईएचएल और पीडीक्यूए वस्तुतः टाइप I फाइबर से रहित थे। हाइब्रिड I/IIA फाइबर कम प्रतिशत में सभी मांसपेशियों में मौजूद थे। जैसा कि अपेक्षित था, टाइप I और IIA फाइबर एकमात्र के कुल फाइबर के 82% से अधिक के लिए जिम्मेदार थे। यह मांसपेशी लगभग सबसे तेज़ IIB फाइबर से रहित है। फाइबर प्रकारों के प्रोफाइल के अनुसार, एकमात्र सबसे धीमा है और पीडीक्यूए विश्लेषण किए गए छह में से सबसे तेज मांसपेशी है।

इसके बाद, और क्योंकि यह एकल-फाइबर शारीरिक प्रयोगों के लिए अधिक प्रासंगिक है, इस सवाल का सवाल है कि अलग-अलग एफडीबी से प्राप्त सेल निलंबन में किस प्रकार के फाइबर दिखाई देते हैं, को संबोधित किया गया था। यह पाया गया कि सेल निलंबन में तंतुओं की प्रोफ़ाइल क्रायोसेक्शन में मौजूद तंतुओं की संरचना को दर्शाती है: चार में से तीन अलग-अलग फाइबर टाइप II (चित्रा 5 और तालिका 3) थे।

अंत में, एसडीएस-पेज के माध्यम से उनके एमएचसी आइसोफॉर्म को अलग करके मांसपेशियों की संरचना की पुष्टि की गई। परिणाम इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख में देखे गए सामान्य पैटर्न के अनुरूप थे। एकमात्र MHC IIa और I में समृद्ध था, जबकि EDL, EHL और peronei MHC IIx और IIb में समृद्ध थे, लेकिन I (पूरक चित्रा S4) से रहित थे।

Figure 1
चित्रा 1: अध्ययन का डिजाइन। (ए) विच्छेदन प्रक्रिया शुरू करने से पहले स्थापित किए जाने वाले उपकरण और समाधान। 1. स्टीरियोस्कोप नंबर एक। 2. नीचे से ऊपर तक: एक पोर्टेबल कूलर (पीले मामले) के अंदर पांच आग-पॉलिश पिपेट, विच्छेदन उपकरण और कोलेजनेज शीशियों का एक सेट। 3. फ़िल्टर केस, विच्छेदन कक्ष, टोपी के साथ लेबल ग्लास शीशियों, फ़िल्टर्ड समाधान के साथ रैक। 4. विच्छेदन उपकरण। 5. विच्छेदन कक्ष संख्या दो के साथ स्टीरियोस्कोप एक कैमरा और एक विद्युत उत्तेजक के लिए युग्मित। (बी)चूहों की छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट की विच्छेदन प्रक्रिया जैसा कि आगे चित्रा 2में बताया गया है। (सी) विच्छेदन के बाद, मांसपेशियों के संकुचन और अखंडता अगले प्रोटोकॉल कदम को जारी रखने से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए। बाएं पैनल में बाईं मांसपेशी एक लहराती, हाइपरकॉन्ट्रैक्टेड, अनुत्तरदायी पीएल मांसपेशी (नीला तीर) दिखाती है, जिसका उपयोग अलग-अलग फाइबर प्राप्त करने के लिए नहीं किया जाएगा। इसके बजाय, विच्छेदन प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा करने के लिए और फिर से शुरू करने की जरूरत है. अच्छी तरह से विच्छेदित पीएल समकक्ष (बाएं पैनल में सही मांसपेशी) एक लम्बी उपस्थिति और स्पष्ट रूप से अनुबंध (पूरक वीडियो एस 1) प्रदर्शित करता है। दाईं ओर का पैनल सही, सीधी उपस्थिति के साथ कोलेजनेस समाधान के भीतर दो ईडीएल (नीला तीर) और दो एफडीबी मांसपेशियों को दिखाता है। (डी)एक बार मांसपेशियों को अलग कर रहे हैं, प्रयोगात्मक कक्ष में अलग फाइबर डालना और उनके संकुचन और अखंडता की जांच. बाएं पैनल पर, लाइव (नीला तीर) और मृत पीएल फाइबर। दाहिने पैनल पर, लाइव (नीला तीर) और मृत ईडीएल फाइबर। (ईजी) प्रयोगों के तीन सेट पृथक फाइबर के साथ प्रदर्शन किया गया: (ई) Sarcoplasmic सीए2 + एक चिकोटी के दौरान एकाग्रता माप (चित्रा 3 में परिणाम). (एफ) मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण (चित्रा 4 में प्रस्तुत परिणाम)। यह उदाहरण एक पीएल फाइबर दिखाता है। (जी)मायोसिन भारी श्रृंखला अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस(परिणाम चित्रा 5 में सचित्र)। यह उदाहरण एक अलग एफडीबी फाइबर दिखाता है। स्केल बार = 5 मिमी (बी, सी), 100 माइक्रोन (डी, एफ, जी)। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PL = पेरोनस लॉन्गस; EDL = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: शारीरिक संदर्भ और माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट को विच्छेदन करने की सामान्य प्रक्रिया। पंक्तियाँ, ऊपर से नीचे तक, विच्छेदन के सर्वोत्तम क्रम के अनुसार मांसपेशियों को प्रस्तुत करती हैं: FDB, एकमात्र, EDL, EHL, PL, और PDQA। कॉलम, बाएं से दाएं, विच्छेदन के दौरान मील के पत्थर प्रस्तुत करते हैं। पहला कॉलम मांसपेशियों या उनके डिस्टल टेंडन को उजागर करता है ताकि विच्छेदन शुरू हो सके। उदाहरण के लिए, नीले तीर एफडीबी और सीटू में एकमात्र और ईडीएल के डिस्टल टेंडन को इंगित करते हैं। निम्नलिखित दो कॉलम विच्छेदन को स्वयं चित्रित करते हैं और डिस्टल टेंडन (ओं) के बाद उजागर होने वाली मांसपेशियों को काट दिया जाता है, जैसा कि लेबल किया गया है, उदाहरण के लिए, ईडीएल पंक्ति में नीले तीर के साथ। यह अनुशंसा की जाती है कि पांचवें अंक के लिए निर्देशित एफडीबी की शाखा को हटा दिया जाए। सबसे दाहिना स्तंभ मांसपेशियों को एक बार पूरी तरह से हटा दिया जाता है, समीपस्थ tendons छवियों के ऊपरी भाग के लिए उन्मुख होता है। नीली, असंतत रेखाएं (चरम दाएं स्तंभ) अनुदैर्ध्य या विकर्ण कटौती का वर्णन करती हैं जिन्हें एकमात्र और ईडीएल मांसपेशियों में प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोलेजन उनके थोक में प्रवेश करता है। स्केल बार = 5 मिमी. संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; ईएचएल = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस; PDQA = peroneus digiti quarti. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीए2 + माउस की छह hindlimb मांसपेशियों का एक सेट से प्राप्त फाइबर में दर्ज क्षणिक.(ए) मंद रोशनी के तहत सीए2+ यात्रियों के अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जाने वाला सेटअप। बाएं पैनल: 1. पीएमटी एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (2) से जुड़ा है। 3. कैमरा माइक्रोस्कोप से जुड़ा हुआ है। 4. इलेक्ट्रिक उत्तेजक प्रयोगात्मक कक्ष के लिए युग्मित। 5. माइक्रोमैनिपुलेशन सिस्टम का उपयोग तब किया जा सकता है जब इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और इंजेक्शन परख सीए2+ यात्रियों के अधिग्रहण के पूरक के लिए योजना बनाई जाती है। मध्य पैनल: भरी हुई कोशिकाओं के साथ प्रयोगात्मक कक्ष (डालने) माइक्रोस्कोप के मंच पर मुहिम शुरू की है और नीले प्रकाश (450-490 एनएम, नीले तीर) डाई उत्तेजित करने के साथ रोशन है. इस सेटअप में, आइटम 1 से 5 को एक एंटीवाइब्रेशन टेबल पर और फैराडे के पिंजरे के अंदर रखा जाता है। दायां पैनल: एक बार संकुचन और डाई लोडिंग की गुणवत्ता कैमरे (6) के साथ सत्यापित हो जाने के बाद, उत्सर्जित प्रकाश पीएमटी को निर्देशित किया जाता है, विद्युत उत्तेजना शुरू होती है, और सिग्नल डिजिटाइज़र (7) और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (8) को खिलाया जाता है सीए2+ क्षणिक रिकॉर्ड करने के लिए। एक लाइव प्रयोग के दौरान इन तत्वों के एकीकृत समारोह पूरक वीडियो S6 में देखा जा सकता है. (बी) प्रतिनिधि, एफडीए के कैलिब्रेटेड सीए2 + क्षणिक, पीडीक्यूए, पीएल, ईडीएल, ईएचएल, और माउस के एकमात्र फाइबर. एफडीबी, पीडीक्यूए, पीएल, ईडीएल और ईएचएल के समान, तेजी से, संकीर्ण संकेत पुष्टि करते हैं कि उनके पास एमटी -2 पहले से ही आईआईएक्स और आईआईबी फाइबर से प्राप्त होने के लिए जाना जाता है, जो इन मांसपेशियों में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं। इसके विपरीत, एकमात्र क्षणिक धीमा और छोटा होता है, जो एमटी-आई का विशिष्ट होता है, जिसे मूल रूप से I और IIA फाइबर में वर्णित किया गया है। ईडीएल और एकमात्र संकेतों पर लाल वक्र दर्शाता है कि एमटी-आई और एमटी-II के क्षय चरण को एक द्विघातीय क्षय फ़ंक्शन के साथ लगाया जा सकता है। अंशांकन बार सभी पैनलों पर लागू होते हैं। ऊर्ध्वाधर पट्टी = [Ca2+] का 2.5 μM, क्षैतिज पट्टी = 10 ms। तल पर रंग कुंजी मांसपेशियों की पहचान करने में मदद करती है। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; ईएचएल = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस; पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब; MT-I = आकृति विज्ञान प्रकार I; MT-II = आकृति विज्ञान प्रकार II। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट के एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त छोटे, मध्यवर्ती और लंबे तंतुओं के मॉर्फोमेट्रिक माप। प्रत्येक मांसपेशी से बरकरार, स्वस्थ, प्रतिनिधि फाइबर को सबसे बाएं स्तंभ पैनलों में दर्शाया गया है। छवियों को केवल पृष्ठभूमि शोर को कम करने और इसके विपरीत बढ़ाने के लिए संपादित किया गया था, जिसमें मांसपेशियों के तंतुओं का कोई प्रत्यक्ष हेरफेर नहीं था। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन (सभी पैनलों). माप प्रोटोकॉल, साथ ही उपस्थिति और पूर्ण लंबे फाइबर की गुणवत्ता, आगे पूरक चित्रा एस 1 में देखा जा सकता है. मध्य स्तंभ लंबाई के वितरण को दर्शाता है, मांसपेशियों से आदेश दिया जाता है जो सबसे छोटे फाइबर (एफडीबी) को सबसे लंबे फाइबर (एकमात्र) के साथ प्रदान करता है। लंबाई की एक निरंतरता है ताकि मांसपेशियों के बीच कुछ ओवरलैप हो, जो कुल ~ 5.5 मिमी तक फैला हो। व्यास वितरण सबसे दाहिने स्तंभ पैनलों में प्रस्तुत किए जाते हैं। अधिकांश फाइबर 30 और 60 माइक्रोन के बीच होते हैं, मांसपेशियों के बीच छोटे अंतर के साथ। मॉर्फोमेट्रिक माप के परीक्षण-पुनर्परीक्षण विश्लेषण (एन = 78 फाइबर, एन = 792 के पूरे नमूने के 9.85% के बराबर) ने परिणामों की अच्छी विश्वसनीयता पर प्रकाश डालते हुए बहुत अधिक प्रजनन क्षमता (1.77% ─ आत्मविश्वास अंतराल 95%, CI95%, 1.26-2.27% ─ 0.99 के सहसंबंध के औसत गुणांक (CI95% 0.98-0.99)) को दिखाया। गाऊसी वितरण घटता रेखांकन लाइसेंस प्राप्त सॉफ्टवेयर के साथ जोड़ा गया. पूरक चित्रा एस 2 लंबाई और व्यास के औसत मूल्यों के बार भूखंडों और आसान तुलना के लिए सभी मांसपेशियों की लंबाई और व्यास वितरण के विलय से पता चलता है। तल पर रंग कुंजी मांसपेशियों की पहचान करने में मदद करती है। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; EHL, = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अलग एफडीबी मांसपेशियों में सेल निलंबन में फाइबर प्रकार के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख। विभिन्न क्षेत्रों की छवियां बरकरार दिखाती हैं, अलग-अलग एफडीबी फाइबर स्लाइड के नीचे का पालन करते हैं। (ए) एक एंटीमायोसिन द्वितीय-पॉजिटिव फाइबर (हरा प्रतिदीप्ति, विकर्ण हल्का नीला तीर) स्पष्ट रूप से एक नकारात्मक (हल्के नीले तीरहेड) के विपरीत है, जो परख की भेदभाव शक्ति का प्रदर्शन करता है। छवि में दोनों तंतुओं की उपस्थिति नाभिक (नीले प्रतिदीप्ति) की लेबलिंग की वजह से पुष्टि की जा सकती है. (बी) एक अलग क्षेत्र एक और एंटीमायोसिन द्वितीय पॉजिटिव फाइबर से पता चलता है. (सी) एंटीबॉडी द्वारा ए बैंड (हरी प्रतिदीप्ति) में मायोसिन भारी श्रृंखला की सही पहचान की पुष्टि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की गई थी। सबसे कुख्यात ट्रांसवर्सल ब्लैक स्ट्राइएशन I बैंड के अनुरूप हैं, जो एक्टिन में समृद्ध हैं, और इस प्रकार एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाने की उम्मीद नहीं है। (डी) बैंगनी में हेमेटोक्सिलिन लेबल ठेठ परिधीय, प्रचुर मात्रा में नाभिक, और ईोसिन फाइबर के सार्कोप्लाज्म को लेबल करता है, जो एक अक्षुण्ण, परिपक्व कोशिका दिखाता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए, बी, डी); 10 माइक्रोन (सी)। संक्षिप्तीकरण: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फाइबर एफडीबी और ईडीएल सोलियस पीडीक्यूए, पीएल और ईएचएल p
n 12 6 14
एफ/एफ 0.68±0.15 0.46±0.06*,† 0.66±0.12 <0.01
[सीए2+] (माइक्रोन) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0.01
आरटी (एमएस) 0.95±0.10 1.26±0.20*,† 0.95±0.09 <0.01
राइज स्लोप (F/ms) 5.97±1.41 3.12±0.79*,† 5.83±0.97 <0.01
एचडब्ल्यू (एमएस) 3.59±0.85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0.01
डीटी (एमएस) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0.01
क्षय ढलान (F/ms) -0.24±0.07 -0.10±0.03*,† -0.35±0.08* <0.01
τ1 (एमएस) 1.86±0.37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0.05
τ2 (एमएस) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0.01
एक1 (%) 48.14±7.27 25.94±8.98*,† 44.59±8.29 <0.01
एक2 (%) 51.86±7.27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0.01
शब्‍दरूप विज्ञान एमटी-II मीट्रिक टन-I एमटी-II

तालिका 1: माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के एक सेट से प्राप्त एंजाइमेटिक रूप से अलग फाइबर में सीए2+ ट्रांजिएंट्स कैनेटीक्स। मान मानक विचलन ± माध्य हैं। पी मान विचरण परीक्षण के विश्लेषण के अनुरूप हैं। *एफडीबी और ईडीएल समूहों से काफी अलग। †पीडीक्यूए, पीएल और ईएचएल समूहों से काफी अलग। संक्षिप्ताक्षर: एफ = प्रतिदीप्ति; [सीए2+] = साइटोसोलिक पीक सीए2+ एकाग्रता; आरटी = वृद्धि का समय; HW = अधिकतम आधी अवधि; डीटी = क्षय समय; τ1 और τ2 = क्षय के समय स्थिरांक; ए1 और ए2 = क्षय के आयाम; FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; ईएचएल = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस; MT-I = आकृति विज्ञान प्रकार I; MT-II = आकृति विज्ञान प्रकार II।

फाइबर एफडीबी पीडीक्यूए पीएल ईडीएल ईएचएल सोलियस p
n 370 142 80 70 87 43
लंबाई (मिमी) 0.42±0.05* 2.20±0.26** 2.69±0.26† 3.51±0.53†† 3.83±0.44‡ 4.62±0.64 <0.01
व्यास (μm) 38.40±9.40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0.01

तालिका 2: माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट के एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त लघु, मध्यवर्ती और लंबे तंतुओं के मॉर्फोमेट्रिक माप। मान मानक विचलन ± माध्य हैं। पी मान विचरण परीक्षण के विश्लेषण के अनुरूप हैं। *पीडीक्यूए, पीएल, ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र से सांख्यिकीय रूप से अलग। **पीएल, ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। †ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। ††ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। ‡एकमात्र से काफी अलग। ईएचएल से काफी अलग। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; EHL = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस।

मांसपेशी/तंतु N n कुल प्रकार I + I/IIA (%) कुल प्रकार II (%)
एफडीबी 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*एफडीबी 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

तालिका 3: क्रायोसेक्शन में फाइबर प्रकार और माउस की अलग एफडीबी मांसपेशियों में सेल निलंबन में। मान मानक विचलन ± माध्य हैं। एन जानवरों की संख्या को संदर्भित करता है, जबकि एन प्रयोगों में विश्लेषण किए गए तंतुओं की कुल संख्या को संदर्भित करता है। एफडीबी पंक्ति क्रायोसेक्शन में निर्धारित पूरी मांसपेशियों का डेटा प्रस्तुत करती है, जबकि * एफडीबी पंक्ति मांसपेशियों को अलग करने के बाद सेल निलंबन में पृथक फाइबर से मेल खाती है। "कुल प्रकार II" कॉलम शुद्ध फाइबर प्रकार IIA, IIX और IIB को दर्शाता है। संक्षिप्तीकरण: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस।

मांसपेशियां N n प्रकार I (%) प्रकार I/IIA (%) प्रकार आईआईए (%) IIX टाइप करें (%) IIB (%) टाइप करें कुल प्रकार II (%)
पीडीक्यूए 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
पीएल 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35.85±5.66 35.66±9.36 94.52±3.90
ईडीएल 4 826 0.00±0.00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89.56±8.33
ईएचएल 5 618 0.24±0.76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
सोलियस 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

तालिका 4: मांसपेशियों के क्रायोसेक्शन में फाइबर प्रकार जो माउस के मध्यवर्ती और लंबे फाइबर देते हैं। मान मानक विचलन ± माध्य हैं। एन जानवरों की संख्या को संदर्भित करता है, जबकि एन प्रयोगों में विश्लेषण किए गए तंतुओं की कुल संख्या को संदर्भित करता है। सभी पंक्तियाँ क्रायोसेक्शन में निर्धारित पूरी मांसपेशियों का डेटा प्रस्तुत करती हैं। टाइप I, IIA, IIX और IIB कॉलम शुद्ध फाइबर को दर्शाते हैं, जबकि I/IIA कॉलम हाइब्रिड फाइबर को संदर्भित करता है। "कुल प्रकार II" स्तंभ IIA, IIX और IIB स्तंभों का योग है. संक्षिप्ताक्षर: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; EHL = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस।

पूरक फ़ाइल 1: मायोसिन भारी श्रृंखला अभिव्यक्ति पूरे मांसपेशियों में अध्ययन। प्रोटोकॉल क्रायोसेक्शन में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा और पूरी मांसपेशियों के समरूप में सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म के निर्धारण के लिए विवरण प्रस्तुत करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट के एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त तंतुओं की आकृति विज्ञान का विवरण। (ए) माइक्रोस्कोप माइक्रोमीटर अंशांकन शासक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पैमाने को सेट करने के लिए खुला बाईं ओर दिखाया गया है। सही पैनल से पता चलता है कि कैसे व्यास को बार-बार मापा गया था जैसा कि फाइबर (नीले तीर) की लंबी धुरी के लंबवत नीली रेखाओं द्वारा इंगित किया गया था, जबकि लंबाई को टिप से टिप तक एक बार मापा गया था जैसा कि नीली रेखा द्वारा चित्रित किया गया था फाइबर की प्रमुख धुरी। (बी) पीडीक्यूए, पीएल, ईडीएल, ईएचएल, और एकमात्र फाइबर (छोटे नीले, हरे, पीले, नारंगी, और गुलाबी आवेषण) की लंबी और स्वस्थ उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए मामूली संपादन के साथ कई छवियों को इकट्ठा किया गया था। इकट्ठे छवियों को तंतुओं को बेहतर रूप देने के लिए संपादित किया गया था (बड़े, काले और सफेद चित्र)। (सी) एफडीबी, पीडीक्यूए, पीएल, और एकमात्र फाइबर की डीआईसी छवियां उनके टिप की सामान्य अनियमितता और उनके प्रसिद्ध ट्रांसवर्सल धारियों को उजागर करती हैं। शेष ईडीएल और ईएचएल फाइबर की डीआईसी उपस्थिति पूरक वीडियो एस 3 और पूरक वीडियो एस 4 में देखी जा सकती है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. तल पर रंग कुंजी मांसपेशियों की पहचान करने में मदद करती है। संक्षिप्ताक्षर: FDB, flexor digitorum brevis; पीडीक्यूए, पेरोनस डिजिटी क्वार्टी; पीएल, पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल, एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; ईएचएल, एक्सटेंसर हेलुसिस लॉन्गस; डीआईसी = विभेदक हस्तक्षेप विपरीत। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: बार भूखंडों और माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट के एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त तंतुओं की लंबाई और व्यास वितरण। (ए) बार प्लॉट (मानक विचलन ± माध्य) और (बी) विलय किए गए हिस्टोग्राम लंबाई की असमानता की पुष्टि करते हैं लेकिन सभी समूहों में व्यास की समानता। *पीडीक्यूए, पीएल, ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। **पीएल, ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। †ईडीएल, ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। ††ईएचएल और एकमात्र से काफी अलग। ‡एकमात्र से काफी अलग। ईएचएल से काफी अलग। तल पर रंग कुंजी मांसपेशियों की पहचान करने में मदद करती है। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; EHL = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट के फाइबर प्रकार संरचना के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन। विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि एंटीबॉडी-लेबल वाले क्रायोसेक्शन नमूनों की अच्छी गुणवत्ता और अक्षुण्णता को प्रदर्शित करते हैं। सभी मांसपेशियों में फाइबर प्रकार II की स्पष्ट प्रबलता है, एकमात्र को छोड़कर जिसमें फाइबर प्रकार I की मात्रा काफी है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. तल पर रंग कुंजी मांसपेशियों की पहचान करने में मदद करती है। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; EHL = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: माउस के छह हिंदलिंब मांसपेशियों के सेट में एमएचसी आइसोफॉर्म का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण। (ए) अलग-अलग नमूनों के साथ अलग-अलग दिनों में चलने वाले दो प्रतिनिधि पूर्ण जैल एमएचसी आइसोफॉर्म के पृथक्करण और प्रवास दूरी की गुणवत्ता, स्वच्छता और प्रजनन क्षमता को प्रदर्शित करते हैं जब कोमासी नीले रंग के साथ दाग दिया जाता है। यद्यपि इन दो छवियों को पाठक के लिए विपरीत और स्पष्टता बढ़ाने के लिए थोड़ा संपादित किया गया था, विश्लेषण असंपादित जैल में किए गए थे। (बी) छह मांसपेशियों में से प्रत्येक के लिए बैंड के विश्लेषण के उदाहरण। जेल की गलियों में आरओआई का चयन करने के बाद, एक प्लॉट प्रोफाइल उत्पन्न होता है और छह मांसपेशियों के सेट में एमएचसी आइसोफॉर्म के अनुपात का अनुमान लगाने के लिए एक गाऊसी फिट का उपयोग किया जाता है। एमएचसी संरचना मिली थी: एफडीबी: आई 9.0 ± 5.0%, आईआईए + आईआईएक्स 91.0 ± 5.0% (एन = 3); पीडीक्यूए: आईआईए + आईआईएक्स 25.9 ± 2.4%, आईआईबी 74.1 ± 2.4% (एन = 3); पीएल: आईआईए + आईआईएक्स 24.9 ± 2.2%, आईआईबी 75.1 ± 2.2% (एन = 3); ईडीएल: आईआईए + आईआईएक्स 22.0 ± 2.3%, आईआईबी 78.0 ± 2.3% (एन = 4); ईएचएल: आईआईए + आईआईएक्स 27.5 ± 1.0%, आईआईबी 72.5 ± 1.0% (एन = 3); एकमात्र: I 35.8 ± 2.5%, IIa (+IIx + IIb जब मौजूद हो) 64.2 ± 2.5% (n = 4)। तल पर रंग कुंजी मांसपेशियों की पहचान करने में मदद करती है। ए में सबसे दाहिने जेल के नीचे ग्रे आयत आणविक भार मार्कर को संदर्भित करता है जो IIa के ~ 200 KDA के प्रवास को दर्शाता है। संक्षिप्ताक्षर: FDB = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = पेरोनस लॉन्गस; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; ईएचएल = एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस; MHC = मायोसिन भारी श्रृंखला; ROI = ब्याज का क्षेत्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S1: क्षतिग्रस्त, लहराती, पेरोनस लॉन्गस (पीएल, बाएं) उत्तेजना पर अनुबंध नहीं करता है, जबकि बरकरार पीएल (दाएं) अच्छी तरह से अनुबंध करता है, भले ही यह इलेक्ट्रोड से दूर हो। 0.8x आवर्धन। उत्तेजना प्रोटोकॉल दो इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1.2 एमएस, 0.7 हर्ट्ज और 50 वी के आयताकार वर्तमान दालों को रिलीज करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो S2: पेरोनस लॉन्गस फाइबर का अनुबंध। 20x आवर्धन। विभेदक हस्तक्षेप विपरीत मोड। उत्तेजना प्रोटोकॉल दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1.2 एमएस, 0.5 हर्ट्ज और 50 वी के आयताकार वर्तमान दालों को रिलीज करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो S3: एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस फाइबर का अनुबंध। 20x आवर्धन। विभेदक हस्तक्षेप विपरीत मोड। उत्तेजना प्रोटोकॉल दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1.2 एमएस, 0.5 हर्ट्ज और 50 वी के आयताकार वर्तमान दालों को रिलीज करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो S4: एक्सटेंसर मतिभ्रम लॉन्गस फाइबर का अनुबंध। 20x आवर्धन। विभेदक हस्तक्षेप विपरीत मोड। उत्तेजना प्रोटोकॉल दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1.2 एमएस, 0.5 हर्ट्ज और 50 वी के आयताकार वर्तमान दालों को रिलीज करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो S5. एकमात्र फाइबर का अनुबंध। 20x आवर्धन। विभेदक हस्तक्षेप विपरीत मोड। उत्तेजना प्रोटोकॉल दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1.2 एमएस, 0.5 हर्ट्ज और 50 वी के आयताकार वर्तमान दालों को जारी करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो S6: मैग-फ्लूओ -4 के साथ लोड किए गए एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस फाइबर से सीए2+ क्षणिक की लाइव रिकॉर्डिंग, एएम जैसा कि चरण 4.1.4 में वर्णित है। उत्तेजना प्रोटोकॉल दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1.2 एमएस, 0.5 हर्ट्ज और 50 वी के आयताकार वर्तमान दालों को रिलीज करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

परिपक्व कंकाल की मांसपेशी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध मॉडल के पूरक के लिए, यहां हम छोटे, मध्यवर्ती और लंबे फाइबर के साथ माउस मांसपेशियों की एक श्रृंखला के सफल एंजाइमेटिक पृथक्करण का प्रदर्शन करते हैं। ये फाइबर कंकाल की मांसपेशी में सीए2 + यात्रियों के एमटी-द्वितीय कैनेटीक्स की सामान्यता के प्रदर्शन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, बरकरार में फाइबर प्रकार, पूरी मांसपेशियों को वर्गीकृत किया गया था। यह देखते हुए कि एफडीबी शारीरिक प्रयोगों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली मांसपेशी है, पृथक्करण के बाद सेल निलंबन में मौजूद फाइबर के प्रकार का मूल्यांकन किया गया था।

मांसपेशियों के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए छोटे, मध्यवर्ती और लंबे अक्षुण्ण तंतुओं की एक बैटरी
विच्छेदन तकनीक, एंजाइमी उपचार की अवधि, एंजाइम का प्रकार, और विचूर्णन प्रक्रिया प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम हैं बरकरार एंजाइमेटिक रूप से अलग फाइबर प्राप्त करने के लिए। अनावश्यक खिंचाव से बचने के दौरान हाइपोक्सिया के तहत समय को कम करने के लिए विच्छेदन जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। उत्तरार्द्ध बिंदु एकमात्र के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है, जिसे गैस्ट्रोकनेमियस-एकमात्र परिसर को खींचकर हटाया नहीं जाना चाहिए। इसके अलावा, एक व्यापक एंजाइमी उपचार (~ 3 एच)20,48 और खराब विचूर्णन प्रक्रियाएं (जैसे, कठोर, शोधकर्ता का कम अनुभव) कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाती हैं, जैसा कि कई प्रयोगशालाओं में अनुभवजन्य रूप से पुष्टि की गई है। अन्य कोलेजन प्रकारों पर कोलेजनेज टाइप 2 की सिफारिश की जाती है। विचूर्णन के दौरान बुलबुले के गठन से बचा जाना चाहिए और या तो मांसपेशियों या तंतुओं को प्लास्टिक विंदुक युक्तियों के बजाय केवल ग्लास पिपेट के साथ हेरफेर किया जाना चाहिए। प्लास्टिक, शंकु शीशियों पर पूरी प्रक्रिया के दौरान कांच की शीशियों का उपयोग पसंद किया जाता है, क्योंकि पहले अधिक दृश्यता देते हैं, मांसपेशियों के शीर्ष-दृश्य अवलोकन के लिए स्टीरियोस्कोप पर ऊपर की ओर रखा जा सकता है जब समाधान में, अधिक जगह देते हैं एफडीबी की तुलना में मांसपेशियों के विचूर्णन के लिए लंबे और थोक, और ग्लास पाश्चर पिपेट के कारण खरोंच के प्रतिरोधी हैं। चूंकि उम्र, वजन और चयापचय की स्थिति (जैसे, स्वस्थ बनाम उच्च वसा वाला मोटापा) विधि की दक्षता को प्रभावित करती है, इसलिए इस पांडुलिपि में उपयोग की जाने वाली सीमा से जानवरों के साथ काम करते समय कई मापदंडों को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। महत्वपूर्ण बात, इस तरह के उन यहाँ इस्तेमाल किया उन और एक सही हदबंदी प्रक्रिया के रूप में कुछ एंजाइमों के लिए एक मांसपेशी के हल्के जोखिम कार्यात्मक तंतुओं को प्रभावित नहीं करते हैं, के रूप में कई समूहों द्वारा दशकों के दौरान एकत्र किए गए सबूत द्वारा दिखाया गया है, जिनमें से कुछ संक्षेप में कुछ साल पहले49. यह आगे इस तथ्य से समर्थित है कि चोटी [सीए2+] मैन्युअल रूप से विच्छेदित बंडलों और चूहों के एंजाइमेटिक रूप से अलग फाइबर में प्राप्त एक चिकोटी के दौरान तेजी से सीए2 + रंगों के साथ मापा जाता है तुलनीय माना जा सकता है (47 में समीक्षा की गई)।

हालांकि मांसपेशी जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अन्य मॉडल हैं, जैसे सी 2 सी 12 मायोट्यूब, सामान्य और उत्परिवर्तित मानव मायोब्लास्ट सेल लाइनें, या प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न फाइबर 31,39,50,51,52,53, वे अपरिपक्व हैं और यहां चर्चा नहीं की गई है। पारगम्य या चमड़ी फाइबर भी जानकारीपूर्ण, अच्छी तरह से विशेषता मॉडल54,55 हैं, लेकिन वे बरकरार नहीं हैं. मैन्युअल रूप से पृथक फाइबर का मॉडल कहीं और20 प्रस्तुत के रूप में कई फायदे प्रदान करता है, लेकिन कम दक्षता है और उच्च प्रशिक्षण की आवश्यकता है। ये तथ्य इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि एंजाइमी पृथक्करण द्वारा प्राप्त ब्याज का मॉडल-विभिन्न प्रकार के बरकरार, प्रचुर मात्रा में, परिपक्व कंकाल मांसपेशी फाइबर प्राप्त करने की संभावना प्रदान करता है। हालांकि, मॉडल की एक सीमा यह है कि टेंडन की कमी पृथक तंतुओं में सिकुड़ा गुणों के प्रत्यक्ष मूल्यांकन को सीमित करती है।

यह देखते हुए कि तंतुओं की लंबाई मांसपेशियों की लंबाई14,42 के समान नहीं है और फाइबर प्रयोग इकाई हैं, यह तंतुओं की लंबाई को वर्गीकृत करने के लिए अधिक प्रासंगिक है, मांसपेशियों की नहीं। हमारे परिणामों और उनके संभावित प्रयोगात्मक प्रभावों को देखते हुए, एफडीबी फाइबर को लघु (<1 मिमी) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है; पीडीक्यूए और पीएल मध्यवर्ती (1 से 3 मिमी) के रूप में; और ईडीएल, ईएचएल, और एकमात्र लंबे (>3 मिमी)। लघु फाइबर सबसे आसान और सबसे प्रचुर मात्रा में प्राप्त (~ माउस प्रति 400-500 फाइबर) हैं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों जिसमें नीचे कक्ष के लिए फाइबर के लगाव कुंजी है, या जब आंदोलन कलाकृतियों से बचा जाना चाहिए (जैसे, सीए2 + क्षणिक). लंबे फाइबर प्राप्त करना सबसे कठिन है, सबसे कम प्रतिपादन है, और पृथक्करण तकनीकों या एकल-कोशिका आणविक जीव विज्ञान अध्ययन का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए बेहतर हैं। मध्यवर्ती फाइबर मध्यम प्रशिक्षण के बाद एक अच्छी मात्रा (~ 50 फाइबर प्रति माउस) में प्राप्त किया जा सकता है और कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के लिए उपयुक्त हैं, जैसा कि सीए2+ यात्रियों के प्रयोगों के साथ उदाहरण के लिए दिखाया गया है। यह स्वीकार करते हुए कि एफडीबी, ईडीएल और एकमात्र का उपयोग पहले किया गया है, यह पीडीक्यूए, पीएल और ईएचएल मांसपेशियों से फाइबर को सफलतापूर्वक अलग करने वाला पहला काम है, इस प्रकार, परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों के अध्ययन के लिए मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, विभिन्न मांसपेशियों से फाइबर प्राप्त करना यह सुनिश्चित करता है कि एक ही जानवर से अधिक जानकारी प्राप्त की जाती है, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करना, सांख्यिकीय शक्ति और निष्कर्षों की जैविक सुदृढ़ता को बढ़ाना और प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करना।

सीए2+ यात्रियों के कैनेटीक्स की सामान्यता
स्तनधारी परिपक्व कंकाल मांसपेशी फाइबर में सीए2 + यात्रियों के कैनेटीक्स का विश्लेषण करते समय, हमने पहले दिखाया है कि फाइबर प्रकार I और IIA तथाकथित आकृति विज्ञान प्रकार I (MT-I) साझा करते हैं, जबकि फाइबर IIX और IIB MT-II आकृति विज्ञान साझा करते हैं। आमतौर पर, एमटी-द्वितीय संकेतों में 1.2 एमएस से कम का आरटी, 25 एमएस से कम का डीटी, 30% से अधिक 1 उच्च, [सीए2+] 15 माइक्रोन से अधिक होता है, और आसानी से एफडीबी और ईडीएल फाइबर33,47में पाया जाता है। PDQA, PL, और EHL के उपन्यास Ca2+ ट्रांजिस्टर के परिणामों की तुलना यहां पाए गए और FDB और EDL के लिए पहले प्रकाशित किए गए परिणामों से करने के बाद, यह निष्कर्ष निकालना सीधा है कि वे सभी MT-II भी हैं। एक और दिलचस्प अवलोकन यह है कि अलग-अलग फाइबर प्राप्त करने के लिए मॉडल के रूप में फाइबर प्रकार IIX और IIB में समृद्ध नई मांसपेशियों की उपलब्धता में वृद्धि से यह पुष्टि करने की अनुमति मिलती है कि सीए2+ यात्रियों के कैनेटीक्स सामान्यीकृत-प्रकार IIX हो सकते हैं और IIB फाइबर में एमटी-II है उनके स्रोत की परवाह किए बिना (यानी, फ्लेक्सर्स (एफडीबी), एक्सटेंसर (ईडीएल और ईएचएल), या पेरोनी (पीडीक्यूए और पीएल))। यह एक स्थापित जीन सेलुलर प्रोग्राम या ईसीसी मशीनरी के प्रोफाइल के विचार को मजबूत करता है, जो एक ही प्रकार के सभी तंतुओं के भीतर समान है, और आणविक मशीनरी (यानी, आइसोफॉर्म और प्रोटीन मात्रा) में अंतर जो सीए2 + ट्रांजिस्टर की पीढ़ी को रेखांकित करता है, फाइबर33 के बीच रिपोर्ट किए गए आकृति विज्ञान में अंतर की व्याख्या करता है। अंत में, एक व्यावहारिक निहितार्थ यह है कि मैग-फ्लूओ -4 के साथ एक फाइबर के सीए2+ क्षणिक रिकॉर्डिंग करके, इसके प्रकार को मज़बूती से जानना संभव है।

मांसपेशियों और पृथक फाइबर में एमएचसी अभिव्यक्ति: शारीरिक प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले फाइबर के प्रकार के लिए निहितार्थ
फाइबर के प्रकार को जानने से मांसपेशियों के अनुसंधान की विश्वसनीयता बढ़ जाती है। उदाहरण के लिए, फाइबर प्रकारों के अनुसार अलग-अलग व्यक्त किए गए किसी भी प्रोटीन के नॉकआउट चूहों में, बिना किसी टाइपिंग के एफडीबी के फाइबर का उपयोग करने से भ्रामक परिणाम हो सकते हैं। हमारे डेटा पुष्टि करते हैं कि एफडीबी आईआईएक्स फाइबर प्रकार की प्रबलता के साथ एक मिश्रित मांसपेशी है, पिछले कागजात 25,31,56 के साथ समझौते में। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि पूरी मांसपेशियों में मौजूद फाइबर प्रकारों के अनुपात और पृथक्करण के बाद प्राप्त होने के बीच एक उच्च सामंजस्य था। चूंकि यह जानकारी उपन्यास है और आमतौर पर एफडीबी फाइबर का उपयोग करके कागजात में चर्चा नहीं की जाती है, इसलिए यह अनुमान लगाया जा सकता है कि, संयोग से, अलग-अलग एफडीबी फाइबर में प्राप्त बहुत सारे परिणाम वास्तव में ~ 20-25% की मिश्रित जानकारी को प्रतिबिंबित कर सकते हैं फाइबर प्रकार I और 75-80% प्रकार II से आ रहा है। एफडीबी मांसपेशियों का उपयोग करने वाले भविष्य के अध्ययनों को फाइबर प्रकारों के सापेक्ष डेटा और उनकी संबंधित चर्चा प्रस्तुत करनी चाहिए।

चूंकि एकमात्र ऑक्सीडेटिव प्रकार I, IIA, और I/IIA फाइबर 57,58,59 में अत्यधिक समृद्ध है, ये पृथक्करण33 के बाद निलंबन में पाए जाने वाले फाइबर हैं। ईडीएल, एक और प्रसिद्ध मांसपेशी, लगभग प्रकार मैं फाइबर 57,58,59 से रहित है, इसलिए पृथक्करण33 के बाद केवल तेजी से फाइबर प्रतिपादन. एक ही तर्क के बाद और तीन उपन्यास मांसपेशियों में प्रकार द्वितीय फाइबर के संवर्धन दिखा टाइपिंग परिणामों के अनुसार, आगे तथ्य यह है कि माउस के peronei मांसपेशियों में पाया कुछ प्रकार मैं फाइबर केंद्रीय60 हैं और एक हल्के पृथक्करण के दौरान पहुंचने की उम्मीद नहीं है द्वारा समर्थित, हम परिकल्पना है कि PDQA के अलग फाइबर के साथ एक प्रयोग में एक तेजी से IIX या IIB फाइबर को रोजगार की संभावना, पीएल, या ईएचएल 80-90% जितना अधिक हो सकता है। यह सीए2+ यात्रियों के डेटा के अनुसार सच प्रतीत होता है जिसमें कोई एमटी-आई सिग्नल नहीं मिला। उनके आकार को देखते हुए, ये फाइबर एक कार्यात्मक प्रयोग खत्म करने के बाद टाइपिंग के लिए उपयुक्त होने का लाभ प्रदान करते हैं। इसके अलावा, एमएचसी II के लिए बीटीएस की विशिष्टता आंदोलन कलाकृतियों को हटाते समय फाइबर प्रकारों के बीच भेदभाव करने में मदद करती है। अंत में, जबकि इस फाइबर टाइपिंग विधि हाल ही में अनुकूलित लोगों61,62 वर्णित की तुलना में अधिक श्रमसाध्य था, यह वर्तमान काम के परिणामों को प्रभावित नहीं किया.

निष्कर्ष
प्रस्तुत पद्धति संबंधी विवरण मांसपेशियों के जीव विज्ञान के अध्ययन में विभिन्न प्रकार के एंजाइमेटिक रूप से अलग मांसपेशी फाइबर के उपयोग को बढ़ावा दे सकते हैं। मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा लंबाई और प्रकार की एक बड़ी रेंज के भीतर फाइबर प्राप्त करने और कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों में उनके उपयोग की संभावना द्वारा समर्थित है। एफडीबी, ईडीएल, और एकमात्र के अलावा जिनके पृथक्करण की सूचना वर्षों पहले दी गई थी, हमने पीडीक्यूए, पीएल और ईएचएल जैसी अन्य मांसपेशियों से मध्यवर्ती और लंबे फाइबर प्राप्त करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। आसानी से जिसके साथ विच्छेदन प्रदर्शन किया जा सकता है और फाइबर है कि प्राप्त किया जा सकता है की संख्या, साथ ही समरूपता और तंतुओं के आकार को देखते हुए, हम परिपक्व कंकाल की मांसपेशी अध्ययन के लिए एक नियमित, उपयुक्त मॉडल के रूप में पीएल का प्रस्ताव. यह हमारे निष्कर्षों द्वारा समर्थित है कि कंकाल की मांसपेशी में सीए2 + यात्रियों के कैनेटीक्स को उनके स्रोत की परवाह किए बिना सामान्यीकृत किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक जानवरों और कुछ तस्वीरों के साथ मदद के लिए और तकनीकी सहायता के लिए कैरोलिना पलासियोस के लिए यूडीए से प्रोफेसर रॉबिन्सन रामिरेज़ का आभार व्यक्त करते हैं। काइका से जोहान पिनेडा ने हमें रंग और प्रतिदीप्ति कैमरे स्थापित करने में मदद की। क्वींसलैंड विश्वविद्यालय के श्युआन न्गो ने कृपया पांडुलिपि को प्रूफरीड किया। इस अध्ययन को CODI-UdeA (2020फरवरी, 34909 से 22 फरवरी, 2021, और 2021-40170 से 31मार्च, 2022, SIU), और प्लानिंग ऑफिस-UdeA (E01708-K और ES03180101), मेडेलिन, कोलंबिया द्वारा JCC द्वारा वित्त पोषित किया गया था। फंडर्स ने डेटा संग्रह और विश्लेषण, पांडुलिपि लेखन या प्रस्तुत करने में भाग नहीं लिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

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जीवविज्ञान अंक 202 कंकाल की मांसपेशी मांसपेशी फाइबर फाइबर प्रकार सीए2+ उत्तेजना-संकुचन युग्मन इम्यूनोफ्लोरेसेंस मायोसिन भारी श्रृंखला
बरकरार छोटे, मध्यवर्ती, और लंबे कंकाल की मांसपेशी फाइबर चूहों की छह हिंदलिंब मांसपेशियों के एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त किया जाता है: फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस से परे
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Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

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