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Biology

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Abstract

Fibras musculares esqueléticas obtidas por dissociação enzimática de músculos de camundongos são um modelo útil para experimentos fisiológicos. No entanto, a maioria dos trabalhos trata das fibras curtas do flexor curto dos dedos (FDB), o que restringe o escopo de resultados que tratam dos tipos de fibras, limita a quantidade de material biológico disponível e impede uma clara conexão entre fenômenos fisiológicos celulares e conhecimentos bioquímicos e dinâmicos prévios obtidos em outros músculos.

Este trabalho descreve como obter fibras intactas de seis músculos com diferentes perfis e comprimentos de tipos de fibras. Usando camundongos adultos C57BL/6, mostramos o protocolo de dissecção muscular e isolamento de fibras e demonstramos a adequação das fibras para estudos transitórios de Ca2+ e sua caracterização morfométrica. A composição do tipo de fibras dos músculos também é apresentada. Quando dissociados, todos os músculos ficaram intactos, fibras vivas que se contraem rapidamente por mais de 24 h. FDB deu curto (<1 mm), fibular dos dedos (PDQA) e fibular longo (PL) deu intermediário (1-3 mm), enquanto extensor longo dos dedos (EDL), extensor longo do hálux (EHL) e músculos sóleo liberaram fibras longas (3-6 mm).

Quando registrados com o corante rápido Mag-Fluo-4, os transientes de Ca2+ das fibras PDQA, PL e EHL mostraram a cinética rápida e estreita que lembra a morfologia tipo II (MT-II), conhecida por corresponder às fibras tipo IIX e IIB. Isso é consistente com o fato de que esses músculos têm mais de 90% de fibras do tipo II em comparação com FDB (~80%) e sóleo (~65%). Indo além do FDB, demonstramos pela primeira vez a dissociação de vários músculos, que tornam fibras que abrangem uma faixa de comprimentos entre 1 e 6 mm. Essas fibras são viáveis e dão rápidos transientes de Ca2+ , indicando que a MT-II pode ser generalizada para fibras rápidas IIX e IIB, independentemente de sua fonte muscular. Esses resultados aumentam a disponibilidade de modelos para estudos do músculo esquelético maduro.

Introduction

O músculo esquelético maduro de mamíferos é um tecido multifuncional. Regula fortemente o metabolismo, é a principal fonte de produção de calor e suas propriedades dinâmicas lhe conferem papel fundamental na respiração, movimentação de segmentos corporais ou deslocamento de um ponto a outro 1,2,3. O músculo esquelético também é relevante para a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo condições hereditárias e crônicas, como miopatias, distrofias ou sarcopenia, bem como muitas condições crônicas não musculares, como doenças cardiometabólicas 3,4,5,6,7,8.

O estudo ex vivo das propriedades estruturais e funcionais do músculo esquelético maduro no contexto da saúde e da doença tem sido possível principalmente através de dois modelos experimentais: músculo inteiro e fibras isoladas. Noséculo 20, pesquisadores exploraram as propriedades dos músculos extensor longo dos dedos (EDL), sóleo, tibial anterior e gastrocnêmio de diferentes espécies pequenas como modelos fundamentais para aprender sobre unidades motoras, tipos de fibras e propriedades dinâmicas, como força e cinética de contração e relaxamento 9,10,11,12,13,14,15,16. No entanto, o advento de estudos mais refinados de biologia celular direcionou a área para o estudo das fibras musculares únicas. Trabalhos pioneiros possibilitaram, então, o isolamento de fibras flexoras curtas dos dedos intactas (FDB) de ratos por dissociação enzimática para posterior caracterização17,18,19. Embora as fibras FDB também possam ser obtidas por dissecção manual20, a facilidade e o alto rendimento de dissociação enzimática dos músculos murinos, além de sua adequação a uma variedade de abordagens experimentais, tornaram este último modelo amplamente utilizado nas últimas duas décadas.

As fibras curtas de FDB são adequadas para estudos eletrofisiológicos e outros estudos biofísicos, análises bioquímicas, metabólicas e farmacológicas, experimentos de microscopia eletrônica e de fluorescência, transfecção para abordagens de biologia celular, ou como fonte de células-tronco em estudos de miogênese 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. No entanto, o uso apenas de fibras FDB em experimentos musculares estreita o escopo de pesquisas que lidam com tipos de fibras e limita a quantidade de material biológico disponível para algumas técnicas metodológicas ou para obter mais informações de um animal. Essas limitações impedem uma clara correlação dos fenômenos fisiológicos celulares com estudos bioquímicos e dinâmicos prévios realizados em diferentes músculos inteiros e intactos (por exemplo, EDL, sóleo, fibular).

Superando essas limitações, alguns grupos conseguiram dissociar os músculos EDL e sóleo mais longos 24,33,34,35,36,37,38,39,40, abrindo a porta para estender ainda mais o método para outros músculos relevantes. No entanto, o uso de EDL e fibras sóleos ainda é escasso, provavelmente devido à falta de detalhes metodológicos para obtê-las como fibras intactas. Aqui, descrevemos detalhadamente como isolar fibras de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos: três deles já descritos (FDB, EDL e sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux [EHL], fibular longo [PL] e fibular dos dedos [PDQA]). Os resultados do presente trabalho confirmam que o modelo de fibras enzimaticamente dissociadas é adequado para uma ampla gama de estudos e futuras correlações com dados previamente publicados, aumentando assim a disponibilidade de modelos para estudos de músculo esquelético maduro.

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Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com animais da Universidade de Antioquia (UdeA) (atas 104 de 21 de junho de 2016 e 005 de 15 de abril de 2021), de acordo com a Lei 84 de 1989 e a Resolução 8430 de 1993 emitida pelo Governo Colombiano e foram realizados e relatados em conformidade com a Pesquisa Animal: Diretrizes de relatórios de experimentos in vivo (ARRIVE)41. Todos os resultados aqui apresentados provêm de camundongos machos saudáveis, com 7-13 semanas de idade, 20-26 g, C57BL/6. A Figura 1 mostra o desenho geral deste estudo e a ordem dos procedimentos. Todos os reagentes, materiais e detalhes do equipamento estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais

  1. Abrigar um máximo de seis ratos por gaiola acrílica, transparente, retangular, com cama derivada de madeira, em condições controladas de temperatura (21 ± 2 °C) e ciclos luz:escuridão (12:12 h).
  2. Dar aos animais livre acesso a alimentos e água da torneira em instalações específicas livres de patógenos sem enriquecimento ambiental.

2. Dissecção

  1. Soluções, materiais e reagentes
    1. Preparar e filtrar (0,22 μm) as soluções de trabalho com a seguinte composição (todas as concentrações em mM):
      1. Tyrode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glicose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissociação: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Solução salina tamponada com fosfato (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Preparar duas câmaras de dissecção; estereoscópio; tesoura de operação; tesoura fina; pinça fina; e frascos de vidro limpos, transparentes, não cônicos, com 1-1,5 cm de largura, de 3-4 mL de volume total com tampas. Dispor um sistema para estimular eletricamente os músculos nas câmaras de dissecção.
    3. Prepare pipetas de vidro Pasteur polidas a fogo de diferentes pontas de largura: 5, 4, 3, 2 e 1 mm.
    4. Ajuste o banho-maria a 37 °C. Pesar alíquotas de 3 mg de colagenase tipo 2.
  2. Procedimento
    1. Sacrifique o rato usando métodos aprovados pelo Comitê de Ética local. A luxação cervical é recomendada por ser rápida, menos estressante e evitar a exposição a medicamentos, que podem afetar o tecido muscular (como CO2 ou alguns anestésicos). Iniciar a dissecção imediatamente para obter melhores resultados.
    2. Coloque o mouse sobre uma superfície de espuma e tape ou fixe os membros anteriores. Corte ambos os membros posteriores sobre os joelhos com a tesoura de operação, transfira cada um deles para uma câmara de dissecção separada e adicione Tyrode frio (10-20 °C) para cobrir o tecido.
      NOTA: Cada membro posterior dará seis músculos diferentes na seguinte ordem: FDB, sóleo, EDL, EHL, PL e PDQA. Referências anatômicas detalhadas para dissecar os seis músculos íntegros de tendão a tendão são dadas na Figura 2 e em outros artigos42.
    3. Fixar o primeiro membro posterior à câmara de dissecção em uma posição em que a face posterior das pernas seja visível. Remover a pele sob aumento; em seguida, expor e remover o FDB (Figura 2). Conservar num frasco para injetáveis de vidro rotulado com 1 ml de solução de Tyrode.
      NOTA: Ampliação adequada e treinamento prévio são necessários para evitar qualquer corte indesejado no tecido muscular.
    4. Expor, remover e armazenar o sóleo num frasco para injetáveis separado com 1 ml de Tyrode. Use uma tesoura fina para separar primeiro o gastrocnêmio e depois remover o sóleo, como indicado na Figura 2.
    5. Expor a face anterior da perna, remover a pele e identificar os tendões distais do tibial anterior e os músculos EDL no tornozelo. Retirar e descartar a tíbia; em seguida, cortar os tendões distais do EDL (Figura 2). Continue a dissecção até remover o EDL e coloque-o num frasco para injetáveis de vidro separado com 1 ml de Tyrode.
    6. Remova o músculo EHL, que fica logo posterior e medial ao EDL. Iniciar dissecção identificando e acompanhando o tendão até o1º dígito, conforme indicado no painel correspondente da Figura 2. Mantenha o músculo num frasco para injetáveis de vidro separado com 1 ml de Tyrode.
    7. Identificar e acompanhar o tendão mais externo do fibular para cortá-lo e remover o músculo PL (Figura 2). Coloque o músculo num frasco para injetáveis de vidro separado com 1 ml de Tyrode.
    8. Identificar e acompanhar o tendão até o4º dígito; cortá-lo e retirar o músculo PDQA (Figura 2). Colocá-lo num frasco para injetáveis de vidro separado com 1 ml de Tyrode.
    9. Repita o procedimento com o segundo membro pélvico.
    10. Reúna ambos os músculos do mesmo tipo num frasco para injetáveis de vidro rotulado ou numa pequena placa de Petri com solução de Tyrode.
      NOTA: Se mais de dois pares de músculos forem planejados para serem dissecados durante uma sessão de trabalho, recrute dois pesquisadores para o procedimento de dissecção.

3. Protocolo de isolamento das fibras musculares

  1. Renove a solução de Tyrode nas câmaras de dissecção para remover detritos e pelos de rato. Despeje os músculos FDB em uma câmara de dissecção, verifique sua integridade e transfira-os para um novo frasco de vidro com 1 mL de solução de dissociação. Repita esse procedimento com os músculos EHL, PL e PDQA.
    NOTA: Se um músculo parecer hipercontraído, cortado ou não responder à estimulação elétrica, não continue para a próxima etapa do protocolo. Em vez disso, otimize o protocolo de dissecção, verificando a qualidade das soluções (pH, contaminação, osmolaridade) e ganhando mais habilidades de dissecção (Figura 1C e Vídeo Suplementar S1).
  2. Realizar cortes longitudinais ou diagonais nos músculos sóleo e EDL, seguindo a orientação das fibras (Figura 2). Para o sóleo, siga o tendão central, cortando ~80% de seu comprimento. Para EDL, basta seguir um ou dois tendões e cortar aproximadamente o mesmo comprimento que para o sóleo. Coloque cada par de músculos em frascos para injetáveis de vidro com 1 ml de solução de dissociação.
    OBS: Este procedimento torna o EDL e o sóleo menores e permite que a colagenase entre melhor no tecido. Ampliação suficiente (40-50x), bem como tesouras finas e pinças, são obrigatórias. Sempre verifique a integridade da amostra por inspeção visual e estimulação elétrica antes de prosseguir para a próxima etapa do protocolo de dissociação.
  3. Adicionar 3 mg de colagenase tipo 2 (com uma atividade de 250-300 U/mg) a cada frasco para injetáveis contendo 1 ml de solução de dissociação e um par de músculos. Padronizar a quantidade exata de colagenase considerando a atividade do lote enzimático utilizado.
  4. Incubar os pares de músculos em banho-maria por 65-90 min a 36,8-37 °C, com agitação suave.
    OBS: Seja rigoroso com o controle de temperatura. Padronize o procedimento para que os músculos não permaneçam na colagenase por mais de 100 min para evitar danos.
  5. Verifique os frascos para injetáveis sob ampliação do estereoscópio a cada 5 min após o65º min de incubação. Quando os músculos parecerem ligeiramente ondulados, esfarrapados e soltos, agite suavemente o frasco para injetáveis e verifique se algumas fibras começam a se desprender prontamente. Se este for o caso, lave os músculos com Tyrode à temperatura ambiente para inativar e remover a colagenase.
    OBS: A lavagem deve ser feita com cuidado, sem tocar os músculos com as pipetas. Comece por adicionar 0,8 ml de Tyrode e, em seguida, remova 0,8 ml da solução. Repita esse procedimento de 4 a 5 vezes e verifique se a solução se torna totalmente transparente.
  6. Separe mais fibras da maior parte dos músculos com trituração muito suave em Tyrode com a ajuda do conjunto de pipetas Pasteur polidas a fogo. Comece agitando a solução ao redor do músculo com a pipeta mais larga (ponta de 5 mm) e, em seguida, puxe suavemente os músculos para dentro e para fora da pipeta 3-4x. Quando o músculo começar a liberar fibras e ficar mais fino, repita o procedimento com a próxima pipeta (ponta de 4 mm).
    NOTA: As fibras renderizadas por meio deste procedimento permanecem excitáveis e se contraem rapidamente por mais de 24 h, como exemplificado usando fibras PL, EDL, EHL e sóleo em Vídeo Suplementar S2, Vídeo Suplementar S3, Vídeo Suplementar S4 e Vídeo Suplementar S5.

4. Procedimentos experimentais

NOTA: Fibras isoladas foram usadas para estimativas da concentração de Ca2+ sarcoplasmático, medidas morfométricas e estudos de expressão da cadeia pesada de miosina (MHC).

  1. Dosagem do Ca sarcoplasmático2+ concentração durante uma contração
    1. Monte uma lâmina de vidro limpa na câmara de banho experimental. Cubra a lâmina com 2-3 μL de laminina e deixe secar por 30 s antes de despejar ~400 μL da suspensão de fibra sobre a lâmina. Deixe as fibras aderirem à laminina por 10-15 min à temperatura ambiente.
    2. Monte a câmara experimental no palco de um microscópio invertido equipado para epifluorescência (Figura 3A).
    3. Evocar contrações simples para verificar a viabilidade das fibras aplicando pulsos de corrente retangular (0,8-1,2 ms) através dos dois eletrodos de platina colocados ao longo de cada lado da câmara experimental. Mesmo quando aderida à laminina, a contração das fibras ainda é visível principalmente nos extremos.
    4. Carregar as fibras com 3,5-4,5 μM do corante rápido Ca2+ Mag-Fluo-4, AM por 4-5 min em solução de Tyrode. Após este tempo, lave suavemente com Tyrode para remover o corante extracelular. Deixe o corante intracelular ser desesterificado por ~15-20 min em condições escuras. Mantenha sempre a temperatura abaixo de 22 °C para evitar a compartimentação do corante.
      NOTA: Preparar um estoque de Mag-Fluo-4, AM apenas em dimetilsulfóxido (DMSO), de modo que a concentração final de DMSO na solução de Tyrode de carga seja inferior a 0,5%.
    5. Iluminar a fibra com um diodo emissor de luz branca (LED) e um conjunto de filtros com os seguintes comprimentos de onda para excitação/dicroico/emissão: 450-490/510/515 nm (Figura 3A).
      NOTA: Fontes alternativas de excitação incluem lâmpadas de fluorescência de mercúrio e xenônio. Use a menor intensidade e tamanho possível do ponto de excitação para evitar o fotobranqueamento do corante e danos à célula.
    6. Evocar a resposta de Ca2+ da fibra (transientes sarcoplasmáticos de Ca2+ ) aplicando pulsos de corrente retangular (0,8-1,2 ms) através dos dois eletrodos de platina colocados ao longo de cada lado da câmara experimental a 20-22 °C.
    7. Colete e salve os sinais luminosos com uma objetiva de longa distância de imersão em óleo de 40x adequada para fluorescência e um tubo fotomultiplicador (PMT) conectado a um digitalizador (Figura 3A e Vídeo Suplementar S6). Garantir uma escala no software de aquisição de 0-200 unidades arbitrárias (UA) e definir a fluorescência de repouso (Frest) do experimento para 10 UA nessa escala, modulando o tamanho do ponto de excitação e o ganho do PMT. Uma vez padronizado o procedimento, mantenha o ganho inalterado de um experimento para o outro e defina a escala apenas através de pequenos ajustes no tamanho do ponto.
      NOTA: Se surgirem artefactos de movimento, utilize 20-30 μM de N-benzil-p-tolueno sulfonamida (BTS) na solução de Tyrode.
    8. Analise e calibre os sinais da seguinte forma:
      1. Filtro passa-baixa todo o traço em 1 kHz.
      2. Calcular o repouso F em 1 s do traço, ajustar o repouso F para 0 e medir a amplitude dos transientes Ca2+ do pico sarcoplasmático (pico F). Apresente a amplitude como na equação (1):
        Equation 1(1º)
      3. Calcular o pico de concentração de Ca2+ ([Ca2+], μM) usando a equação (2)26 e os seguintes parâmetros: constante de dissociação in situ (Kd) = 1,65 × 105 μM2, fluorescência máxima (Fmax) de 150,9 UA, fluorescência mínima (Fmin) de 0,14 UA, concentração de Mag-Fluo-4 [D]T de 229,1 μM26. Opico F já foi obtido na etapa 4.1.8.2.
        Equation 2(2º)
      4. Meça o tempo de ascensão de 10% a 90% da amplitude (TR, ms), a duração na metade máxima (HW, ms) e o tempo de decaimento de 90% a 10% da amplitude (DT, ms). Em seguida, estime a cinética de decaimento de acordo com um ajuste com a função biexponencial (equação 3):
        Equation 3(3º)
      5. Salve os valores das constantes de tempo de decaimento τ1 e τ2 (ms) e amplitudes A1 e A226.
  2. Medidas morfométricas
    1. Monte uma lâmina de vidro limpa na câmara de banho experimental. Cubra a lâmina com 2-3 μL de laminina e deixe secar por 30 s antes de despejar ~400 μL da suspensão de fibra sobre a lâmina. Deixe as fibras aderirem à laminina por 10-15 min à temperatura ambiente.
    2. Evocar contrações simples para verificar a viabilidade das fibras aplicando pulsos de corrente retangular (0,8-1,2 ms) através dos dois eletrodos de platina colocados ao longo de cada lado da câmara experimental. Mesmo quando aderida à laminina, a contração das fibras ainda é visível principalmente nos extremos.
    3. Adquira imagens das fibras vivas usando objetivas de 10x e 20x e uma câmera de pelo menos 5 megapixels montada em um microscópio de fluorescência invertido. Armazene as imagens em . Formato TIFF para análises offline.
      NOTA: Um conjunto de ~2-6 imagens pode ser necessário para capturar completamente uma fibra longa.
    4. Imagem de uma régua de calibração micrométrica do microscópio sob a mesma ampliação. Armazene as imagens em . Formato TIFF para análises offline.
    5. Meça os comprimentos e diâmetros das fibras utilizando a ferramenta de calibração do software livre para análise de imagens da seguinte forma:
      1. Estabeleça uma relação entre os pixels e a distância conhecida (μm) nas imagens com a ajuda da régua de calibração do micrômetro do microscópio usando a ferramenta Analyze/Set scale como mostrado na Figura Suplementar S1.
      2. Meça comprimentos uma vez de uma ponta para a outra da fibra e diâmetros em 2-6 lugares diferentes ao longo da fibra (1-2 medidas por imagem, dependendo de seu comprimento), como na Figura Suplementar S1.
      3. Relate o valor do comprimento (μm ou mm) e a média de todos os diâmetros (μm) medidos por fibra.
  3. Estudos de expressão da cadeia pesada de miosina
    NOTA: Para detalhes sobre a determinação de MHC por imunofluorescência43 e eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)33,44,45,46 em músculos inteiros, consulte Arquivo Suplementar 1. O protocolo para a determinação por imunofluorescência do MHC na suspensão de fibras isoladas de FDB é o seguinte:
    1. Cubra cada uma das cinco lâminas de vidro limpas com 2-3 μL de laminina e deixe secar por 30 s antes de despejar ~300 μL da suspensão de fibra em cada lâmina. Deixe as fibras aderirem à laminina por 4 h à temperatura ambiente.
    2. Fixar as preparações com acetona refrigerada em congelador por 30 min à temperatura ambiente.
    3. Lave suavemente 3x com PBS.
    4. Permeabilizar as membranas celulares com PBS suplementado com Triton X-100 a 0,7% por 15 min à temperatura ambiente.
    5. Lavar suavemente 3x com PBS suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,04% de Triton X-100 e, em seguida, bloquear com PBS com 2% de BSA, 2% de soro de cabra e 0,4% de Triton X-100 por 30 min à temperatura ambiente.
    6. Lavar suavemente 3x com PBS suplementado com BSA a 0,2% e Triton X-100 a 0,04% e incubar com os anticorpos primários da seguinte forma:
      1. Diluir cada anticorpo primário anti-MHC em um frasco separado em PBS com BSA a 1% e Triton X-100 a 0,04%: anti-I (1:1.500), anti-II (1:600), anti-IIA (use meios condicionados inteiros do hibridoma) e anti-IIB (1:500).
      2. Incubar cada lâmina com um anticorpo e a lâmina restante com PBS como controle por 12-16 h a 4 °C.
        OBS: Neste protocolo, as fibras do tipo IIX permaneceram não marcadas em todas as amostras.
    7. Lavar suavemente 3x com PBS e incubar todas as lâminas com o anticorpo secundário (1:800) acoplado a uma molécula verde fluorescente por 1-2 h à temperatura ambiente.
    8. Núcleos corados com 1 μg/mL Hoechst por 15 min.
    9. Lave suavemente 3x com PBS, adicione cuidadosamente 20-40 μL de meio de montagem e coloque uma lamínula.
      NOTA: Trocas suaves de soluções e lavagem garantem que dezenas de fibras permaneçam presas à lâmina, tornando o experimento estatisticamente correto.
    10. Visualize cada lâmina usando uma objetiva de 10x adequada para fluorescência e um conjunto de filtros com os seguintes comprimentos de onda para excitação/dicroico/emissão: 450-490/510/515 nm e conte todas as fibras positivas e negativas. Alternativamente, adquira imagens de fluorescência usando as mesmas condições técnicas e uma câmera de pelo menos 5 megapixels montada em um microscópio de fluorescência invertida e armazene-as em . Formato TIFF para análises offline.
    11. Registre as fibras positivas e negativas de cada lâmina em um banco de dados e calcule as porcentagens de fibras I, IIA, IIB e II total positivas com base no número total de fibras presentes na lâmina correspondente. Calcular a porcentagem de fibras IIX subtraindo a soma de IIA+IIB da porcentagem de fibras II totais. Estimar a porcentagem de fibras híbridas I/IIA subtraindo a soma de I+II de um valor de 100%. Finalmente, subtrair a porcentagem de células híbridas do total de I e II para ter as fibras puras do tipo I e II.
      NOTA: Em estudos de composição MHC, os tipos de fibras são designados por uma letra maiúscula, enquanto as isoformas são designadas por uma letra minúscula46.
  4. Coloração para hematoxilina e eosina
    1. Cubra uma lâmina de vidro limpa com 2-3 μL de laminina e deixe secar por 30 s antes de despejar ~300 μL da suspensão de fibra sobre a lâmina. Deixe as fibras aderirem à laminina por 4 h à temperatura ambiente.
    2. Fixar a preparação com solução de Carnoy (etanol absoluto a 60%, clorofórmio a 30%, ácido acético a 10%) durante 5 minutos à temperatura ambiente.
    3. Incubar com hematoxilina por 90 s.
    4. Lave suavemente 3x com água da torneira.
    5. Incubar com 1% de eosina Y preparada em etanol 70% por 30 s.
    6. Lave suavemente 3x com água da torneira.
    7. Mergulhe 3x em etanol absoluto.
    8. Incubar em xilol por 60 s.
    9. Adicione 20-40 μL de meio de montagem e visualize com um microscópio convencional. Adquira imagens na ampliação desejada usando uma câmera colorida de pelo menos 5 megapixels.

5. Análise estatística e gráficos

NOTA: A unidade experimental é uma fibra muscular.

  1. Expresse os resultados como média ± desvio padrão e calcule intervalos de confiança de 95% (IC95%) para algumas análises.
  2. Para comparar comprimento, diâmetro e cinética de transientes de Ca2+ entre os grupos, realizar análise de variância (ANOVA) e testes post-hoc com correção de Bonferroni.
  3. Avaliar a normalidade e a igualdade de variância por meio dos testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente.
  4. Considere-se as diferenças significativas quando p < 0,05.

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Representative Results

Concentração de Ca2+ sarcoplasmático durante uma contração
Para demonstrar a viabilidade de experimentos fisiológicos no conjunto de fibras dissociadas e estender nossos achados anteriores sobre acoplamento excitação-contração (CCE) e tipos de fibras, transientes de Ca2+ foram adquiridos em fibras de todos os músculos. Primeiro, FDB (n = 5) e EDL (n = 7) apresentaram cinética de Ca2+ conhecida como morfologia tipo II (MT-II). Estes são sinais rápidos, espinhosos, cujo RT dura ~1 ms; sua fase de decaimento pode ser ajustada com uma função biexponencial com o primeiro componente (A1) maior que 30% de toda a amplitude, e seu pico [Ca2+] está entre 15 e 30 μM33,47(Figura 3B). Seus resultados são agrupados (n = 12) na primeira coluna da Tabela 1, enquanto os resultados dos transientes Ca2+ do sóleo (n = 6) são apresentados na segunda coluna da Tabela 1. Os sinais do sóleo foram classificados em morfologia tipo I (MT-I, Figura 3B) -mais larga, com TR acima de 1,2 ms, A1 menor que 30% e pico [Ca2+] entre 7 e 13 μM33,47. Essas duas colunas foram consideradas referências para a comparação dos transientes de Ca2+ dos novos músculos. Como todas as fibras do PDQA (n = 4), PL (n = 6) e EHL (n = 4) compartilharam o MT-II (Figura 3B), seus dados são agrupados (n = 14) na terceira coluna da Tabela 1. Esses sinais mostraram um TR médio de ~1 ms, um A1 de ~45%, um pico [Ca2+] acima de 15 μM, e se comparam muito bem com os resultados apresentados na primeira coluna, mas diferem claramente daqueles mostrados na segunda coluna, como confirmado pela análise estatística (Tabela 1). O sinal mais rápido de toda a amostra foi proveniente de uma fibra de EHL, com ΔF/F de 0,66, [Ca2+] de 16,99 μM, TR de 0,85 ms, CH de 2,42 ms e DT de 10,56 ms. τ1 e τ2 foram de 1,63 e 7,21 ms, respectivamente, enquanto os valores de A1 e A2 foram de 56,60% e 43,40%. O sinal mais lento foi proveniente de uma fibra sóleo, com ΔF/F de 0,41, [Ca2+] de 9,76 μM, TR de 1,56 ms, CH de 9,43 ms e DT de 31,88 ms. τ1 e τ2 foram de 2,81 e 96,42 ms, respectivamente, enquanto os valores de A1 e A2 foram de 19,55% e 80,45%. 

Uma bateria de fibras curtas, intermediárias e longas
A observação de nítidas diferenças entre as fibras de acordo com sua fonte muscular possibilitou uma caracterização morfométrica mais completa. Os histogramas da Figura 4 mostram variações marcantes no comprimento das fibras em todos os músculos. Isso é destacado quando se compara a fibra mais curta do FDB (227,06 μm) com a mais longa do sóleo (5,69 mm). Os valores médios de comprimento estão resumidos na Tabela 2. Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p < 0,01). Esses resultados permitem classificar as fibras FDB em curtas (<1 mm); PDQA e PL como intermediários (1 a 3 mm); e EDL, LHE e sóleo de comprimento (>3 mm) (Figura Suplementar S2).

Por outro lado, pequenas diferenças foram observadas nos diâmetros médios das fibras de todos os músculos (Tabela 2) e na distribuição dos valores (Figura 4). Ainda assim, houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p < 0,01). Quando avaliados detalhadamente, houve diferenças entre o FDB e o outro músculo e entre o FDB (FDB 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) e o pool de fibras intermediárias e longas (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). A célula mais fina de toda a amostra media 18,42 μm (FDB) e a mais espessa atingia 82,79 μm (PDQA).

Tipos de fibras utilizados em experimentos fisiológicos
Primeiramente, os tipos de fibras presentes em cada músculo total foram determinados por imunofluorescência. Com exceção do sóleo, os músculos apresentaram predomínio de mais de 76% de fibras do tipo II (Figura Suplementar S3, Tabela 3 e Tabela 4). EHL, PL e PDQA são músculos particularmente rápidos, com mais de 90% de fibras rápidas e até 58,8% de fibras do tipo IIB, como encontrado no PDQA. EHL e PDQA foram virtualmente desprovidos de fibras do tipo I. Fibras híbridas I/IIA estavam presentes em todos os músculos em baixas porcentagens. Como esperado, as fibras do tipo I e IIA representaram mais de 82% do total de fibras do sóleo. Este músculo é quase desprovido das fibras IIB mais rápidas. De acordo com o perfil dos tipos de fibras, o sóleo é o mais lento e o PDQA é o músculo mais rápido dos seis analisados.

A partir daí, e por ser mais relevante para experimentos fisiológicos com monofibra, foi abordada a questão de quais tipos de fibras aparecem na suspensão celular derivada do FDB dissociado. Verificou-se que o perfil das fibras na suspensão celular reflete a composição das fibras presentes nas criossecções: três das quatro fibras dissociadas eram do tipo II (Figura 5 e Tabela 3).

Finalmente, a composição dos músculos foi confirmada pela separação de suas isoformas MHC através de SDS-PAGE. Os resultados foram consistentes com o padrão geral observado nos ensaios de imunofluorescência. O sóleo foi enriquecido em MHC IIa e I, enquanto o EDL, EHL e fibular foram enriquecidos em MHC IIx e IIb, mas foram desprovidos de I (Figura Suplementar S4).

Figure 1
Figura 1: Desenho do estudo. (A) Equipamentos e soluções a serem montados antes do início do procedimento de dissecção. 1. Estereoscópio número um. 2. De baixo para cima: um conjunto de cinco pipetas polidas a fogo, ferramentas de dissecção e frascos de colagenase dentro de um refrigerador portátil (caixa amarela). 3. Caixa do filtro, câmara de dissecção, frascos de vidro rotulados com tampa, cremalheira com soluções filtradas. 4. Ferramentas de dissecação. 5. Estereoscópio com câmara de dissecção números dois acoplado a uma câmera e um estimulador elétrico. (B) O procedimento de dissecção do conjunto de seis músculos dos membros pélvicos de camundongos, conforme explicado na Figura 2. (C) Após a dissecção, a contração e a integridade muscular devem ser verificadas antes de prosseguir para a próxima etapa do protocolo. O músculo esquerdo no painel esquerdo mostra um músculo PL ondulado, hipercontraído e sem resposta (seta azul), que não deve ser usado para obter fibras dissociadas. Em vez disso, o protocolo de dissecção precisa ser otimizado e iniciado novamente. A contraparte PL bem dissecada (músculo direito no painel esquerdo) exibe uma aparência alongada e visivelmente contraída (Supplemental Video S1). O painel à direita mostra dois músculos EDL (seta azul) e dois FDB dentro da solução de colagenase com a aparência correta e reta. (D) Uma vez dissociados os músculos, despeje as fibras isoladas na câmara experimental e verifique sua contração e integridade. No painel esquerdo, fibras PL vivas (seta azul) e mortas. No painel direito, fibras EDL vivas (seta azul) e mortas. (E-G) Três conjuntos de experimentos foram realizados com as fibras isoladas: (E) Medidas da concentração de Ca2+ sarcoplasmático durante uma contração (resultados na Figura 3). (F) Análise morfométrica (resultados apresentados na Figura 4). Este exemplo mostra uma fibra PL. (G) Imunofluorescência para estudos de expressão da cadeia pesada da miosina (resultados ilustrados na Figura 5). Este exemplo mostra uma fibra FDB isolada. Barras de escala = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Referências anatômicas e procedimento geral para dissecar o conjunto de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. As fileiras, de cima para baixo, apresentam os músculos de acordo com a melhor ordem de dissecção: FDB, sóleo, EDL, EHL, PL e PDQA. As colunas, da esquerda para a direita, apresentam os marcos durante a dissecção. A primeira coluna mostra os músculos ou seus tendões distais expostos para que a dissecção possa começar. Por exemplo, setas azuis apontam para o FDB e sóleo in situ e para os tendões distais do EDL. As duas colunas a seguir ilustram a dissecção propriamente dita e os músculos expostos após o corte do(s) tendão(s) distal(is), como rotulado, por exemplo, com a seta azul na linha EDL. Recomenda-se que o ramo do FDB direcionado para o quinto dígito seja removido. A coluna mais à direita apresenta os músculos completamente removidos, com os tendões proximais orientados para a parte superior das imagens. Linhas azuis e descontínuas (coluna extrema direita) ilustram os cortes longitudinais ou diagonais que precisam ser realizados nos músculos sóleo e EDL para garantir que a colagenase entre em seu volume. Barras de escala = 5 mm. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEP = extensor longo do hálux; PDQA = fibular dos dígitos quárticos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Transientes de Ca2+ registrados em fibras obtidas de um conjunto de seis músculos dos membros pélvicos de camundongos. (A) Configuração utilizada para a aquisição de transientes Ca2+ sob iluminação esmaecida. Painel esquerdo: 1. PMT conectado a um microscópio de fluorescência invertida (2). 3. Câmera acoplada ao microscópio. 4. Estimulador elétrico acoplado à câmara experimental. 5. O sistema de micromanipulação pode ser usado quando ensaios de eletrofisiologia e injeção são planejados para complementar a aquisição de transientes de Ca2+ . Painel do meio: a câmara experimental (inserto) com as células carregadas é montada no palco do microscópio e iluminada com luz azul (450-490 nm, seta azul) para excitar o corante. Nesta configuração, os itens 1 a 5 são colocados sobre uma mesa antivibração e dentro de uma gaiola de Faraday. Painel direito: Uma vez verificada a qualidade da contração e do carregamento do corante com a câmera (6), a luz emitida é direcionada para o PMT, inicia-se a estimulação elétrica e o sinal é alimentado ao digitalizador (7) e ao software de aquisição (8) para registrar o transiente Ca2+ . A função integrada desses elementos durante um experimento ao vivo pode ser vista no Supplemental Video S6. (B) Transientes Ca2+ representativos e calibrados de fibras FDB, PDQA, PL, EDL, EHL e sóleo de camundongos. Os sinais semelhantes, rápidos e estreitos de FDB, PDQA, PL, EDL e EHL confirmam que eles já têm MT-II conhecido por derivar das fibras IIX e IIB, que são as mais abundantes nesses músculos. Em contraste, o transiente sóleo é mais lento e menor, típico de MT-I, originalmente descrito nas fibras I e IIA. A curva vermelha sobre os sinais EDL e sóleo demonstra que a fase de decaimento de MT-I e MT-II pode ser ajustada com uma função de decaimento biexponencial. As barras de calibração aplicam-se a todos os painéis. Barra vertical = 2,5 μM de [Ca2+], barra horizontal = 10 ms. A chave de cor na parte inferior ajuda a identificar os músculos. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEP = extensor longo do hálux; TPM = tubo fotomultiplicador; MT-I = morfologia tipo I; MT-II = morfologia tipo II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Medidas morfométricas das fibras curtas, intermediárias e longas obtidas por dissociação enzimática do conjunto de seis músculos dos membros pélvicos de camundongos. Fibras intactas, saudáveis e representativas de cada músculo são representadas nos painéis de coluna mais à esquerda. As imagens foram editadas apenas para reduzir o ruído de fundo e aumentar o contraste, sem manipulação direta das fibras musculares. Barras de escala = 100 μm (todos os painéis). O protocolo de medição, bem como a aparência e a qualidade das fibras longas completas, podem ser visualizadas na Figura Suplementar S1. A coluna do meio mostra as distribuições dos comprimentos, ordenados desde o músculo que produziu as fibras mais curtas (FDB), até aquele com as fibras mais longas (sóleo). Há um contínuo de comprimentos para que haja alguma sobreposição entre os músculos, abrangendo um total de ~5,5 mm. As distribuições diamétricas são apresentadas nos painéis de coluna mais à direita. A maioria das fibras está entre 30 e 60 μm, com pequenas diferenças entre os músculos. As análises teste-reteste (n = 78 fibras, equivalente a 9,85% da amostra total de n = 792) das medidas morfométricas mostraram reprodutibilidade muito alta (coeficiente de variação médio de 1,77%─intervalo de confiança 95%, IC95%, 1,26-2,27%─coeficiente médio de correlação de 0,99 (IC95% 0,98-0,99)), evidenciando a boa confiabilidade dos resultados. Curvas de distribuição gaussianas foram adicionadas com software licenciado para gráficos. A Figura S2 suplementar mostra gráficos de barras dos valores médios de comprimento e diâmetro e as fusões das distribuições de comprimento e diâmetro de todos os músculos para facilitar a comparação. A tecla de cor na parte inferior ajuda a identificar os músculos. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; EH, = extensor longo do hálux. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensaios de imunofluorescência para tipos de fibras na suspensão celular em músculos dissociados FDB. Imagens de diferentes campos mostram fibras FDB intactas e dissociadas aderidas ao fundo das lâminas. (A) Uma fibra positiva para antimiosina II (fluorescência verde, seta azul clara diagonal) contrasta claramente com uma fibra negativa (cabeça de seta azul clara), demonstrando o poder de discriminação do ensaio. A presença de ambas as fibras na imagem pode ser confirmada devido à marcação dos núcleos (fluorescência azul). (B) Um campo diferente mostra outra fibra positiva para antimiosina II. (C) A correta identificação da cadeia pesada da miosina nas bandas A (fluorescência verde) pelos anticorpos foi confirmada por microscopia confocal. As estrias negras transversais mais notórias correspondem às bandas I, enriquecidas em actina, e por isso não se espera que sejam reconhecidas pelos anticorpos. (D) A hematoxilina rotula em roxo os núcleos periféricos típicos e abundantes, e a eosina marca o sarcoplasma da fibra, mostrando uma célula madura e intacta. Barras de escala = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Abreviação: FDB = flexor digitorum brevis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fibras FDB e EDL Sóleo PDQA, PL e EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0,68±0,15 0.46±0.06*,† 0,66±0,12 <0.01
[Ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0.01
RT (ms) 0,95±0,10 1.26±0.20*,† 0,95±0,09 <0.01
Inclinação de subida (F/ms) 5,97±1,41 3.12±0.79*,† 5,83±0,97 <0.01
HW (ms) 3,59±0,85 8.17±3.00*,† 3,19±0,54 <0.01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11,32±2.06* <0.01
Decadência (F/ms) -0,24±0,07 -0.10±0.03*,† -0,35±0,08* <0.01
B1 (EM) 1,86±0,37 2,07±0,66† 1,57±0,18 <0.05
τ2 (EM) 11,50±3,93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0.01
A1 (%) 48.14±7.27 25.94±8.98*,† 44.59±8.29 <0.01
A2 (%) 51,86±7,27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0.01
Morfologia MT-II MT-I MT-II

Tabela 1: Cinética dos transientes de Ca2+ em fibras enzimaticamente dissociadas obtidas de um conjunto de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. Os valores são média ± desvio padrão. Os valores de p correspondem ao teste de Análise de Variância. *Significativamente diferente dos grupos FDB e EDL. †Significativamente diferente dos grupos PDQA, PL e EHL. Abreviaturas: F = fluorescência; [Ca2+] = concentração citosólica de pico Ca2+ ; TR = tempo de ascensão; CH = duração na metade do máximo; DT = tempo de decaimento; τ1 e τ2 = constantes de tempo de decaimento; A1 e A2 = amplitudes de decaimento; FDB = flexor curto dos dedos; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEP = extensor longo do hálux; MT-I = morfologia tipo I; MT-II = morfologia tipo II.

Fibras FDB PDQA PL EDL EHL Sóleo p
n 370 142 80 70 87 43
Comprimento (mm) 0,42±0,05* 2,20±0,26** 2,69±0,26† 3,51±0,53†† 3.83±0.44‡ 4,62±0,64 <0.01
Diâmetro (μm) 38,40±9,40* 46,39±9,50 45.98±11.18 44,43±7,62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0.01

Tabela 2: Medidas morfométricas das fibras curtas, intermediárias e longas obtidas por dissociação enzimática do conjunto de seis músculos dos membros pélvicos de camundongos. Os valores são média ± desvio padrão. Os valores de p correspondem ao teste de Análise de Variância. *Estatisticamente diferente de PDQA, PL, EDL, EHL e soleus. **Significativamente diferente de PL, EDL, EHL e soleus. †Significativamente diferente de EDL, EHL e sóleo. ††Significativamente diferente de EHL e sóleo. ‡Significativamente diferente do sóleo. Significativamente diferente do EHL. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEAD = extensor longo do hálux.

Músculos/Fibras N n Total tipo I + I/IIA (%) Total tipo II (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76,54±2,51

Tabela 3: Tipos de fibras nas criossecções e na suspensão celular em músculos FDB dissociados de camundongos. Os valores são média ± desvio padrão. N refere-se ao número de animais, enquanto n refere-se ao número total de fibras analisadas nos experimentos. A fileira FDB apresenta dados de todo o músculo determinados em criossecções, enquanto a linha *FDB corresponde a fibras isoladas na suspensão celular após dissociação do músculo. A coluna "Tipo II total" reflete fibras puras do tipo IIA, IIX e IIB. Abreviação: FDB = flexor digitorum brevis.

Músculo N n Tipo I (%) Tipo I/IIA (%) Tipo IIA (%) Tipo IIX (%) Tipo IIB (%) Total tipo II (%)
PDQA 4 597 0,00±0,00 10.15±2.62 19.33±6.19 11,68±7,57 58,84±7,63 89,85±2,62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35,85±5,66 35,66±9,36 94,52±3,90
EDL 4 826 0,00±0,00 10.44±8.33 5.67±5.07 24,75±10,93 59.15±11.36 89,56±8,33
EHL 5 618 0,24±0,76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94,47±3,05
Sóleo 4 729 32.18±4.48 1,74±1,30 50,37±7,46 14,58±6,94 1.12±1.93 66,08±5,59

Tabela 4: Tipos de fibras em criossecções dos músculos que dão fibras intermediárias e longas de camundongo. Os valores são média ± desvio padrão. N refere-se ao número de animais, enquanto n refere-se ao número total de fibras analisadas nos experimentos. Todas as fileiras apresentam dados de todo o músculo determinados em criossecções. As colunas tipo I, IIA, IIX e IIB refletem fibras puras, enquanto a coluna I/IIA refere-se a fibras híbridas. A coluna "Total tipo II" é a soma das colunas tipo IIA, IIX e IIB. Abreviações: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEAD = extensor longo do hálux.

Arquivo suplementar 1: Estudos de expressão da cadeia pesada de miosina em músculos inteiros. Os protocolos apresentam detalhes para a determinação de isoformas de cadeia pesada de miosina por imunofluorescência em criossecções e por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio em homogeneizados de toda a musculatura. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S1: Detalhes da morfologia das fibras obtidas por dissociação enzimática do conjunto de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. (A) A régua de calibração do micrômetro do microscópio aberta para definir a escala no software de análise de imagens é mostrada à esquerda. O painel direito mostra como o diâmetro foi medido repetidamente como indicado pelas linhas azuis perpendiculares ao longo eixo da fibra (setas azuis), enquanto o comprimento foi medido uma vez de ponta a ponta, como ilustrado pela linha azul ao longo do eixo maior da fibra. (B) Várias imagens foram montadas com pequenas edições para demonstrar a aparência longa e saudável das fibras PDQA, PL, EDL, EHL e sóleo (pequenas inserções azuis, verdes, amarelas, laranjas e rosas). As imagens montadas foram posteriormente editadas para dar às fibras uma melhor aparência (imagens grandes, em preto e branco). (C) Imagens em DIC de fibras FDB, PDQA, PL e sóleo, destacando a irregularidade normal de sua ponta e suas conhecidas estrias transversais. A aparência DIC das fibras EDL e EHL restantes pode ser vista no Supplemental Video S3 e no Supplemental Video S4. Barras de escala = 100 μm. A chave de cor na parte inferior ajuda a identificar os músculos. Abreviações: FDB, flexor digitorum brevis; PDQA, fibular dos dígitos quárticos; PL, fibular longo; EDL, extensor longo dos dedos; EHL, extensor longo do hálux; DIC = Contraste de interferência diferencial. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Gráficos de barras e distribuições mescladas de comprimento e diâmetro das fibras obtidas por dissociação enzimática do conjunto de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. (A) Gráficos de barras (média ± desvio padrão) e (B) histogramas mesclados confirmam a disparidade dos comprimentos, mas a semelhança dos diâmetros entre todos os grupos. *Significativamente diferente de PDQA, PL, EDL, EHL e soleus. **Significativamente diferente de PL, EDL, EHL e soleus. †Significativamente diferente de EDL, EHL e sóleo. ††Significativamente diferente de EHL e sóleo. ‡Significativamente diferente do sóleo. Significativamente diferente do EHL. A chave de cor na parte inferior ajuda a identificar os músculos. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEAD = extensor longo do hálux. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S3: Estudos de imunofluorescência para composição do tipo de fibra do conjunto de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. Criosecções representativas marcadas com anticorpos usadas para as análises demonstram a boa qualidade e integridade das amostras. Há uma clara predominância de fibras do tipo II em todos os músculos, exceto no sóleo, em que a quantidade de fibras do tipo I é considerável. Barras de escala = 100 μm. A chave de cor na parte inferior ajuda a identificar os músculos. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEAD = extensor longo do hálux. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S4: Separação eletroforética das isoformas do MHC no conjunto de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. (A) Dois géis completos representativos executados em dias diferentes com amostras diferentes demonstram a qualidade, limpeza e reprodutibilidade da separação e distância de migração das isoformas MHC quando coradas com azul de Coomassie. Embora essas duas imagens tenham sido levemente editadas para aumentar o contraste e a clareza para o leitor, as análises foram realizadas em géis inéditos. (B) Exemplos das análises das bandas para cada um dos seis músculos. Depois que uma ROI é selecionada nas pistas do gel, um perfil de gráfico é gerado e um ajuste gaussiano é usado para estimar a proporção de isoformas MHC no conjunto de seis músculos. A composição MHC encontrada foi: FDB: I 9,0 ± 5,0%, IIa + IIx 91,0 ± 5,0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4%, IIb 74,1 ± 2,4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2%, IIb 75,1 ± 2,2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3%, IIb 78,0 ± 2,3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0%, IIb 72,5 ± 1,0% (n = 3); sóleo: I 35,8 ± 2,5%, IIa (+IIx + IIb quando presente) 64,2 ± 2,5% (n = 4). A chave de cor na parte inferior ajuda a identificar os músculos. O retângulo cinza abaixo do gel mais à direita em A refere-se ao marcador de peso molecular que indica a migração do IIa para ~ 200 KDa. Abreviações: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = fibular dos dígitos quárticos; PL = fibular longo; EDL = extensor longo dos dedos; PEP = extensor longo do hálux; MHC = cadeia pesada da miosina; ROI = região de interesse. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S1: O fibular longo (PL, esquerdo) danificado, ondulado, não se contrai após a estimulação, enquanto o PL intacto (direito) contrai-se bem, mesmo quando está mais distante dos eletrodos. Ampliação de 0,8x. O protocolo de estimulação libera pulsos de corrente retangular de 1,2 ms, 0,7 Hz e 50 V através de dois eletrodos. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S2: Contração de fibra fibular longa. Ampliação de 20x. Modo de contraste de interferência diferencial. O protocolo de estimulação libera pulsos de corrente retangular de 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V através de dois eletrodos de platina. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S3: Contração da fibra extensora longa dos dedos. Ampliação de 20x. Modo de contraste de interferência diferencial. O protocolo de estimulação libera pulsos de corrente retangular de 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V através de dois eletrodos de platina. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S4: Contração da fibra extensora longa do hálux. Ampliação de 20x. Modo de contraste de interferência diferencial. O protocolo de estimulação libera pulsos de corrente retangular de 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V através de dois eletrodos de platina. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S5. Contração de fibra sóleo. Ampliação de 20x. Modo de contraste de interferência diferencial. O protocolo de estimulação libera pulsos de corrente retangular de 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V, através de dois eletrodos de platina. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S6: Gravação ao vivo de um transiente de Ca2+ de uma fibra extensora longa dos dedos carregada com Mag-Fluo-4, AM, conforme descrito na etapa 4.1.4. O protocolo de estimulação libera pulsos de corrente retangular de 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V através de dois eletrodos de platina. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

Para complementar os modelos disponíveis para o estudo da biologia muscular esquelética madura, demonstramos aqui a dissociação enzimática bem-sucedida de uma variedade de músculos de camundongos com fibras curtas, intermediárias e longas. Essas fibras permitem demonstrar a generalização da cinética MT-II dos transientes de Ca2+ no músculo esquelético. Além disso, os tipos de fibras nos músculos inteiros intactos foram classificados. Tendo em vista que o FDB é o músculo mais utilizado para experimentos fisiológicos, foram avaliados os tipos de fibras presentes na suspensão celular após a dissociação.

Uma bateria de fibras curtas, intermediárias e longas intactas para estudos de biologia muscular
A técnica de dissecção, a duração do tratamento enzimático, o tipo de enzima utilizada e o procedimento de trituração são etapas críticas dentro do protocolo para a obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas intactas. A dissecção deve ser feita o mais rápido possível para reduzir o tempo sob hipóxia, evitando alongamentos desnecessários. Este último ponto é particularmente relevante para o sóleo, que não deve ser removido puxando o complexo gastrocnêmio-sóleo. Além disso, um extenso tratamento enzimático (~3 h)20,48 e procedimentos de trituração deficientes (por exemplo, severos e com baixa experiência do pesquisador) danificam as células, como confirmado empiricamente em vários laboratórios. A colagenase tipo 2 é recomendada em relação a outros tipos de colagenase. A formação de bolhas durante a trituração deve ser evitada e os músculos ou as fibras devem ser manipulados apenas com pipetas de vidro em vez de pontas de pipeta de plástico. O uso de frascos de vidro é preferido durante todo o procedimento em relação aos frascos plásticos, cônicos, porque os primeiros dão mais visibilidade, podem ser colocados para cima no estereoscópio para uma observação de cima do músculo quando nas soluções, dão mais espaço para a trituração dos músculos mais longos e volumosos do que o FDB, e são resistentes a arranhões causados pelas pipetas de vidro Pasteur. Como a idade, o peso e a condição metabólica (por exemplo, obesidade saudável versus obesidade com alto teor de gordura) afetam a eficiência do método, vários parâmetros podem precisar de otimização ao trabalhar com animais fora da faixa usada neste manuscrito. É importante ressaltar que uma leve exposição de um músculo a certas enzimas, como as aqui utilizadas, e um procedimento correto de dissociação não afetam funcionalmente as fibras, como mostram evidências coletadas durante décadas por vários grupos, algumas das quais foram resumidas há alguns anos49. Isso é ainda apoiado pelo fato de que o pico [Ca2+] medido com corantes rápidos de Ca2+ durante uma contração obtida em feixes dissecados manualmente e fibras enzimaticamente dissociadas de camundongos pode ser considerado comparável (revisado em 47).

Embora existam outros modelos para estudos de biologia muscular, como miotubos C2C12, linhagens de células mioblásticas humanas normais e mutadas ou fibras derivadas de células-tronco pluripotentes (iPSC)31,39,50,51,52,53, eles são imaturos e não são discutidos aqui. Fibras permeabilizadas ou esfoladas também são modelos informativos e bem caracterizados54,55, mas não estão intactas. O modelo de fibras isoladas manualmente oferece várias vantagens, como apresentado em outrosestudos20, mas tem baixa eficiência e requer alto treinamento. Esses fatos ressaltam que o modelo de interesse - fibras obtidas por dissociação enzimática - oferece a possibilidade de se obter fibras musculares esqueléticas intactas, abundantes e maduras de diferentes tipos. Uma limitação do modelo, entretanto, é que a ausência de tendões limita a avaliação direta das propriedades contráteis nas fibras isoladas.

Tendo em vista que o comprimento das fibras não é o mesmo que o comprimento dos músculos14,42 e que as fibras são a unidade de experimentação, é mais relevante classificar o comprimento das fibras e não dos músculos. Diante de nossos resultados e de suas potenciais implicações experimentais, as fibras FDB podem ser classificadas em curtas (<1 mm); PDQA e PL como intermediários (1 a 3 mm); e EDL, LHE e sóleo de comprimento (>3 mm). As fibras curtas são as mais fáceis e abundantemente obtidas (~400-500 fibras por camundongo) e são adequadas para experimentos de microscopia de fluorescência em que a fixação da fibra à câmara inferior é fundamental, ou quando artefatos de movimento devem ser evitados (por exemplo, transientes de Ca2+). As fibras longas são as mais difíceis de obter, têm o menor renderização e são melhores para a expressão de proteínas usando técnicas de separação ou estudos de biologia molecular de célula única. Fibras intermediárias podem ser obtidas em boa quantidade (~50 fibras por camundongo) após treinamento moderado e são adequadas para muitas abordagens experimentais, como mostrado, por exemplo, com os experimentos de transientes Ca2+. Reconhecendo que FDB, EDL e sóleo já foram usados anteriormente, este é o primeiro trabalho a isolar com sucesso fibras dos músculos PDQA, PL e EHL, aumentando assim a disponibilidade de modelos para estudos de músculos esqueléticos maduros. Além disso, a obtenção de fibras de diferentes músculos garante que mais informações sejam obtidas de um mesmo animal, reduzindo a variabilidade experimental, aumentando o poder estatístico e a solidez biológica das conclusões e reduzindo o número de animais utilizados na experimentação.

Generalizabilidade da cinética dos transientes de Ca2+
Ao analisar a cinética dos transientes de Ca2+ em fibras musculares esqueléticas maduras de mamíferos, mostramos anteriormente que as fibras tipo I e IIA compartilham a chamada morfologia tipo I (MT-I), enquanto as fibras IIX e IIB compartilham a morfologia MT-II. Tipicamente, os sinais MT-II têm TR menor que 1,2 ms, DT menor que 25 ms, A1 maior que 30%, [Ca2+] acima de 15 μM, e são facilmente encontrados em fibras FDB e EDL33,47. Depois de comparar os resultados dos novos transientes Ca2+ de PDQA, PL e EHL com aqueles encontrados aqui e aqueles publicados anteriormente para FDB e EDL, é simples concluir que todos eles são todos MT-II também. Outra observação interessante é que o aumento da disponibilidade de novos músculos enriquecidos em fibras do tipo IIX e IIB como modelos para obtenção de fibras dissociadas permite confirmar que a cinética dos transientes de Ca2+ pode ser generalizada - as fibras do tipo IIX e IIB possuem a MT-II independentemente de sua fonte (i.e., flexores (FDB), extensores (EDL e EHL), ou peronei (PDQA e PL)). Isso fortalece a ideia de um programa ou perfil celular genético estabelecido da maquinaria de CEC, que é bastante semelhante dentro de todas as fibras do mesmo tipo, e que as diferenças na maquinaria molecular (isto é, isoformas e quantidade de proteína) subjacentes à geração de transientes de Ca2+ explicam as diferenças nas morfologias relatadas entre as fibras33. Por fim, uma implicação prática é que, ao registrar com Mag-Fluo-4 o transiente Ca2+ de uma fibra, é possível conhecer de forma confiável seu tipo.

Expressão de MHC em músculos e fibras isoladas: implicações para tipos de fibras utilizadas em experimentos fisiológicos
Conhecer o tipo de fibra aumenta a confiabilidade da pesquisa muscular. Por exemplo, em camundongos knockout de qualquer proteína diferencialmente expressa de acordo com os tipos de fibra, o uso de fibras do FDB sem qualquer tipagem pode levar a resultados enganosos. Nossos dados confirmam que o DFB é um músculo misto com predomínio de fibras do tipo IIX, concordando com trabalhos anteriores 25,31,56. Mais importante, houve uma alta concordância entre a proporção de tipos de fibras presentes em todo o músculo e aquela obtida após a dissociação. Uma vez que essa informação é nova e não é usualmente discutida em trabalhos utilizando fibras FDB, pode-se especular que, por acaso, muitos resultados obtidos em fibras FDB dissociadas podem realmente refletir informações mistas de ~20-25% provenientes de fibras do tipo I e 75-80% do tipo II. Estudos futuros utilizando o músculo FDB devem apresentar dados e sua correspondente discussão, em relação aos tipos de fibras.

Como o sóleo é altamente enriquecido em fibras oxidativas tipo I, IIA e I/IIA 57,58,59, essas são as fibras encontradas na suspensão após a dissociação33. O EDL, outro músculo bem conhecido, é quase desprovido de fibras do tipo I 57,58,59, tornando, portanto, apenas fibras rápidas após dissociação33. Seguindo a mesma lógica e de acordo com os resultados de tipagem mostrando enriquecimento de fibras do tipo II nos três novos músculos, ainda apoiado pelo fato de que as poucas fibras do tipo I encontradas nos músculos fibulares de camundongos são centrais60 e não se espera que sejam alcançadas durante uma dissociação leve, hipotetizamos que a probabilidade de empregar uma fibra IIX ou IIB rápida em um experimento com fibras dissociadas de PDQA, PL, ou EHL pode ser tão alto quanto 80-90%. Isso parece ser verdadeiro de acordo com os dados dos transientes de Ca2+, nos quais nenhum sinal de MT-I foi encontrado. Dado o seu tamanho, essas fibras oferecem a vantagem de serem adequadas para digitação após o término de um experimento funcional. Além disso, a especificidade do BTS para MHC II ajuda a discriminar entre os tipos de fibras, removendo artefatos de movimento. Finalmente, embora este método de tipagem de fibras tenha sido mais trabalhoso do que os otimizados recentemente descritos61,62, ele não afetou os resultados do presente trabalho.

Conclusões
Os detalhes metodológicos apresentados podem fomentar o uso de uma variedade de fibras musculares enzimaticamente dissociadas no estudo da biologia muscular. A versatilidade do modelo é suportada pela possibilidade de obtenção de fibras dentro de uma ampla gama de comprimentos e tipos e seu uso em diversas aplicações experimentais. Além de FDB, EDL e sóleo, cuja dissociação foi relatada anos atrás, demonstramos a viabilidade de se obter fibras intermediárias e longas de outros músculos, como PDQA, PL e EHL. Dada a facilidade com que a dissecção pode ser realizada e o número de fibras que podem ser obtidas, bem como a homogeneidade e o tamanho das fibras, propomos o LP como um modelo rotineiro e adequado para estudos do músculo esquelético maduro. Isso é apoiado por nossos achados de que a cinética dos transitórios de Ca2+ no músculo esquelético pode ser generalizada independentemente de sua origem.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores expressam sua gratidão ao professor Robinson Ramírez, da UdeA, pela ajuda com os animais e algumas fotos e a Carolina Palacios pelo apoio técnico. Johan Pineda da Kaika nos ajudou a configurar as câmeras coloridas e de fluorescência. Shyuan Ngo, da Universidade de Queensland, gentilmente revisou o manuscrito. Este estudo foi financiado pelo CODI-UdeA (2020-34909 de 22 de fevereiro de 2021 e 2021-40170 de 31 de março de 2022, SIU), e pelo Escritório de Planejamento-UdeA (E01708-K e ES03180101), Medellín, Colômbia, ao JCC. Os financiadores não participaram da coleta e análise dos dados, redação ou submissão do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

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Biologia músculo esquelético fibras musculares tipos de fibras Ca2+ acoplamento excitação-contração imunofluorescência cadeia pesada de miosina
Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos
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Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

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