Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intakte korte, mellomliggende og lange skjelettmuskelfibre oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av seks baklemmusmuskler hos mus: Utover flexor digitorum brevis

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokoll for å oppnå enzymatisk dissosierte fibre av forskjellige lengder og typer fra seks muskler hos voksne mus: tre av dem allerede beskrevet (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) og tre av dem vellykket dissosiert for første gang (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

Skjelettmuskelfibre oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av musemuskler er en nyttig modell for fysiologiske eksperimenter. Imidlertid omhandler de fleste papirene de korte fibrene i flexor digitorum brevis (FDB), som begrenser omfanget av resultater som omhandler fibertyper, begrenser mengden biologisk materiale som er tilgjengelig, og hindrer en klar sammenheng mellom cellulære fysiologiske fenomener og tidligere biokjemisk og dynamisk kunnskap oppnådd i andre muskler.

Dette papiret beskriver hvordan du får intakte fibre fra seks muskler med forskjellige fibertypeprofiler og lengder. Ved hjelp av C57BL / 6 voksne mus viser vi muskeldisseksjons- og fiberisolasjonsprotokollen og demonstrerer fibrenes egnethet for Ca2+ forbigående studier og deres morfometriske karakterisering. Fibertypesammensetningen av musklene presenteres også. Ved dissosiering ga alle muskler intakte, levende fibre som trakk seg raskt sammen i mer enn 24 timer. FDB ga korte (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) og peroneus longus (PL) ga mellomliggende (1-3 mm), mens extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL) og soleusmuskler frigjorde lange (3-6 mm) fibre.

Når det ble registrert med det raske fargestoffet Mag-Fluo-4, viste Ca2+ transienter av PDQA-, PL- og EHL-fibre den raske, smale kinetikken som minner om morfologitypen II (MT-II), kjent for å korrespondere med type IIX- og IIB-fibre. Dette stemmer overens med det faktum at disse musklene har over 90% av type II fibre sammenlignet med FDB (~ 80%) og soleus (~ 65%). Når vi beveger oss utover FDB, demonstrerer vi for første gang dissosiasjonen av flere muskler, som gjør fibre som spenner over en rekke lengder mellom 1 og 6 mm. Disse fibrene er levedyktige og gir raske Ca2+ transienter, noe som indikerer at MT-II kan generaliseres til IIX og IIB raske fibre, uavhengig av muskelkilde. Disse resultatene øker tilgjengeligheten av modeller for modne skjelettmuskelstudier.

Introduction

Den modne skjelettmuskulaturen av pattedyr er et multifunksjonelt vev. Det regulerer stoffskiftet tungt, er hovedkilden til varmeproduksjon, og dets dynamiske egenskaper gir den en nøkkelrolle i respirasjon, bevegelse av kroppssegmenter eller forskyvning fra ett punkt til et annet 1,2,3. Skjelettmuskulatur er også relevant for patofysiologien til mange sykdommer, inkludert arvelige og kroniske tilstander, som myopatier, dystrofier eller sarkopi, samt mange ikke-muskelkroniske tilstander, som kardiometabolske sykdommer 3,4,5,6,7,8.

Ex vivo-studien av de strukturelle og funksjonelle egenskapene til moden skjelettmuskulatur i sammenheng med helse og sykdom har vært mulig hovedsakelig gjennom to eksperimentelle modeller: hel muskel og isolerte fibre. I det 20. århundre utnyttet forskere egenskapene til hele, intakt extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior og gastrocnemius muskler av forskjellige små arter som sentrale modeller for å lære om motoriske enheter, fibertyper og dynamiske egenskaper som kraft og kinetikk av sammentrekning og avslapning 9,10,11,12,13,14,15,16. Imidlertid flyttet fremkomsten av mer raffinerte cellebiologistudier området mot studiet av enkeltmuskelfibre. Pionerarbeid muliggjorde deretter isolering av intakte flexor digitorum brevis (FDB) fibre av rotter ved enzymatisk dissosiasjon for påfølgende karakterisering 17,18,19. Selv om FDB-fibre også kan oppnås ved manuell disseksjon20, har enkelheten og den høye gjennomstrømningen av enzymatisk dissosiasjon av murinmuskler, i tillegg til deres egnethet for en rekke eksperimentelle tilnærminger, gjort sistnevnte modell mye brukt i løpet av de siste to tiårene.

De korte FDB-fibrene er egnet for elektrofysiologiske og andre biofysiske studier, biokjemiske, metabolske og farmakologiske analyser, elektron- og fluorescensmikroskopieksperimenter, transfeksjon for cellebiologiske tilnærminger, eller som kilde til stamceller i myogenesestudier 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Bruk av bare FDB-fibre i muskeleksperimenter begrenser imidlertid omfanget av forskning som omhandler fibertyper og begrenser mengden biologisk materiale som er tilgjengelig for noen metodologiske teknikker eller for å få mer informasjon fra ett dyr. Disse begrensningene hindrer en klar sammenheng mellom cellulære fysiologiske fenomener med tidligere biokjemiske og dynamiske studier utført i forskjellige hele, intakte muskler (f.eks. EDL, soleus, peronei).

Ved å overvinne disse begrensningene lyktes noen grupper i å dissosiere de lengre EDL- og soleusmusklene 24,33,34,35,36,37,38,39,40, og åpnet døren for å utvide metoden ytterligere til andre relevante muskler. Imidlertid er bruken av EDL- og soleusfibre fortsatt knapp, sannsynligvis på grunn av mangel på metodologiske detaljer for å få dem som intakte fibre. Her beskriver vi i detalj hvordan man isolerer fibre av forskjellige lengder og typer fra seks muskler: tre av dem allerede beskrevet (FDB, EDL og soleus) og tre av dem vellykket dissosiert for første gang (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL] og peroneus digiti quarti [PDQA]). Resultatene av det foreliggende arbeidet bekrefter at modellen av enzymatisk dissosierte fibre er egnet for et bredt spekter av studier og fremtidige korrelasjoner med tidligere publiserte data, og dermed øker tilgjengeligheten av modeller for modne skjelettmuskelstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av komiteen for etikk i eksperimenter med dyr ved Universitetet i Antioquia (UdeA) (protokoll 104 av 21. juni 2016 og 005 av 15. april 2021), i henhold til lov 84 av 1989 og resolusjon 8430 av 1993 utstedt av den colombianske regjeringen og ble utført og rapportert i samsvar med dyreforsøket: Retningslinjer for rapportering av in vivo-eksperimenter (ARRIVE)41. Alle resultatene som presenteres her kommer fra friske, 7-13 uker gamle, 20-26 g, C57BL/6 hannmus. Figur 1 viser generell utforming av denne studien og rekkefølgen på prosedyrene. Alle detaljer om reagenser, materialer og utstyr er oppført i materialfortegnelsen.

1. Dyr

  1. Hus maksimalt seks mus per akryl, gjennomsiktig, rektangulær bur, med treavledet sengetøy, under forhold med kontrollert temperatur (21 ± 2 ° C) og lys: mørke (12: 12 h) sykluser.
  2. Gi dyrene fri tilgang til mat og vann fra springen i spesifikke patogenfrie dyrefasiliteter uten miljøberikelse.

2. Disseksjon

  1. Løsninger, materialer og reagenser
    1. Forbered og filtrer (0,22 μm) arbeidsløsningene med følgende sammensetning (alle konsentrasjoner i mM):
      1. Tyrode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glukose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissosiasjon: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Fosfatbufret saltvann (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Forbered to disseksjonskamre; stereoskop; betjening saks; fin saks; fine tang; og rene, gjennomsiktige, ikke-koniske, 1-1,5 cm brede, glassflasker med 3-4 ml totalt volum med lokk. Arrangere et system for elektrisk stimulering av musklene i disseksjonskamrene.
    3. Forbered brannpolerte Pasteur-glasspipetter med forskjellige breddespisser: 5, 4, 3, 2 og 1 mm.
    4. Sett vannbadet på 37 °C. Vei alikoter med 3 mg kollagenase type 2.
  2. Prosedyre
    1. Ofre musen ved hjelp av metoder godkjent av den lokale etiske komiteen. Cervikal dislokasjon anbefales fordi den er rask, mindre stressende og unngår eksponering for legemidler, noe som kan påvirke muskelvevet (som CO2 eller noen anestetika). Start disseksjon umiddelbart for å oppnå bedre resultater.
    2. Plasser musen på en skumoverflate og tape eller pin forbenene. Klipp begge baklemmene over knærne med operasjonssaksen, overfør hver av dem til et separat disseksjonskammer, og tilsett kald (10-20 °C) tyrode for å dekke vevet.
      MERK: Hver baklem vil gi seks forskjellige muskler i følgende rekkefølge: FDB, soleus, EDL, EHL, PL og PDQA. Detaljerte anatomiske referanser for å dissekere de seks musklene intakt fra sene til sene er gitt i figur 2 og andre steder42.
    3. Fest den første bakbenet til disseksjonskammeret i en posisjon der den bakre siden av bena er synlig. Fjern huden under forstørrelse; deretter eksponere og fjerne FDB (figur 2). Oppbevar det i ett hetteglass merket med 1 ml Tyrode oppløsning.
      MERK: Passende forstørrelse og tidligere trening er nødvendig for å unngå uønsket kutt i muskelvevet.
    4. Eksponer, fjern og oppbevar soleus i et separat hetteglass med 1 ml Tyrode. Bruk fin saks for først å skille gastrocnemius og deretter for å fjerne soleus, som angitt i figur 2.
    5. Eksponer det fremre ansiktet av beinet, fjern huden og identifiser de distale senene til tibialis anterior og EDL-musklene i ankelen. Fjern og kast tibialis; Deretter kuttes de distale senene i EDL (figur 2). Fortsett disseksjonen til EDL fjernes og legges i et separat hetteglass med 1 ml Tyrode.
    6. Fjern EHL-muskelen, som ligger like bakre og medialt til EDL. Start disseksjonen ved å identifisere og følge senen til 1. siffer , som angitt i det tilsvarende panelet i figur 2. Oppbevar muskelen i et separat hetteglass med 1 ml Tyrode.
    7. Identifiser og følg den mest ytre senen til peronei for å kutte den og fjerne PL-muskelen (figur 2). Plasser muskelen i et separat hetteglass av glass med 1 ml Tyrode.
    8. Identifiser og følg senen til 4.siffer ; klipp den og fjern PDQA-muskelen (figur 2). Plasser den i et separat hetteglass med 1 ml Tyrode.
    9. Gjenta prosedyren med den andre bakbenet.
    10. Samle begge musklene av samme type i ett hetteglass merket eller en liten petriskål med Tyrode-oppløsning.
      MERK: Hvis mer enn to par muskler er planlagt å bli dissekert under en arbeidsøkt, rekruttere to forskere for disseksjonsprosedyren.

3. Isolasjonsprotokoll for muskelfiber

  1. Forny Tyrode-oppløsningen i disseksjonskamrene for å fjerne rusk og musepels. Hell FDB-musklene i ett disseksjonskammer, verifiser deres integritet og overfør dem til et nytt hetteglass med 1 ml dissosiasjonsløsning. Gjenta denne prosedyren med EHL-, PL- og PDQA-musklene.
    MERK: Hvis en muskel ser hyperkontrahert ut, kuttet eller ikke reagerer på den elektriske stimuleringen, må du ikke fortsette til neste protokolltrinn. I stedet optimaliserer du disseksjonsprotokollen ved å verifisere kvaliteten på løsningene (pH, forurensning, osmolaritet) og få flere disseksjonsferdigheter (figur 1C og tilleggsvideo S1).
  2. Utfør langsgående eller diagonale kutt i soleus- og EDL-musklene, etter fibrenes orientering (figur 2). For soleus, følg den sentrale senen, kutt ~ 80% av lengden. For EDL, følg bare en eller to sener og kutt omtrent samme lengde som for soleus. Sett hvert par muskler i glassflasker med 1 ml dissosiasjonsløsning.
    MERK: Denne prosedyren gjør EDL og soleus mindre og gjør det mulig for kollagenasen å komme bedre inn i vevet. Tilstrekkelig forstørrelse (40-50x), samt fin saks og tang, er obligatorisk. Kontroller alltid prøveintegriteten ved visuell inspeksjon og elektrisk stimulering før du fortsetter til neste trinn i dissosiasjonsprotokollen.
  3. Tilsett 3 mg kollagenase type 2 (med en aktivitet på 250-300 E/mg) til hvert hetteglass med 1 ml dissosiasjonsoppløsning og et par muskler. Standardiser den nøyaktige mengden kollagenase ved å vurdere aktiviteten til enzymbatchen som brukes.
  4. Inkuber musklene i vannbadet i 65-90 min ved 36,8-37 °C, med forsiktig risting.
    MERK: Vær streng med temperaturkontrollen. Standardiser prosedyren slik at musklene ikke forblir i kollagenase i mer enn 100 minutter for å unngå skade.
  5. Sjekk hetteglassene under stereoskopforstørrelse hvert 5. minutt etter inkubasjonens65 . minutt. Når musklene ser litt rippled, fillete og løs, rist forsiktig på hetteglasset og kontroller om noen fibre begynner å løsne lett. Hvis dette er tilfelle, vask musklene med Tyrode ved romtemperatur for å inaktivere og fjerne kollagenasen.
    NOTAT: Vasking må gjøres nøye, uten å berøre musklene med pipettene. Start med å tilsette 0,8 ml Tyrode og fjern deretter 0,8 ml av oppløsningen. Gjenta denne prosedyren 4-5x og kontroller at løsningen blir helt gjennomsiktig.
  6. Separer flere fibre fra hoveddelen av musklene med veldig forsiktig triturering i Tyrode ved hjelp av settet med brannpolerte Pasteur-pipetter. Start med å bearbeide løsningen rundt muskelen med den bredeste pipetten (5 mm spiss) og trekk deretter musklene forsiktig opp og ut av pipetten 3-4x. Når muskelen begynner å frigjøre fibre og blir tynnere, gjenta prosedyren med neste pipette (4 mm spiss).
    MERK: Fibre som gjengis via denne prosedyren, forblir spennende og trekker seg raskt sammen i mer enn 24 timer, som eksemplifisert ved bruk av PL-, EDL-, EHL- og soleusfibre i tilleggsvideo S2, tilleggsvideo S3, tilleggsvideo S4 og tilleggsvideo S5.

4. Eksperimentelle prosedyrer

MERK: Isolerte fibre ble brukt til sarkoplasmatiske Ca2+ konsentrasjonsestimeringer, morfometriske målinger og myosin heavy chain (MHC) ekspresjonsstudier.

  1. Måling av sarkoplasmatisk Ca2+ konsentrasjon under en rykning
    1. Monter et rent glassglass på det eksperimentelle badkammeret. Belegg lysbildet med 2-3 μL laminin og la det tørke i 30 s før du heller ~400 μL av fibersuspensjonen på lysbildet. La fibrene feste seg til laminininet i 10-15 minutter ved romtemperatur.
    2. Monter eksperimentkammeret på scenen i et omvendt mikroskop utstyrt for epifluorescens (figur 3A).
    3. Fremkall enkle rykninger for å verifisere levedyktigheten til fibrene ved å bruke rektangulære strømpulser (0,8-1,2 ms) gjennom de to platinaelektrodene plassert langs hver side av eksperimentkammeret. Selv når den er festet til laminin, er sammentrekningen av fibrene fortsatt synlig hovedsakelig i ytterpunktene.
    4. Legg fibrene med 3,5-4,5 μM av det raske Ca2+ fargestoffet Mag-Fluo-4, AM i 4-5 minutter i Tyrode-løsningen. Etter denne tiden, vask forsiktig med Tyrode for å fjerne det ekstracellulære fargestoffet. La det intracellulære fargestoffet de-esterifiseres i ~ 15-20 minutter under mørke forhold. Hold alltid temperaturen under 22 °C for å unngå fargestoff.
      MERK: Forbered et lager av Mag-Fluo-4, AM kun i dimetylsulfoksid (DMSO), slik at den endelige konsentrasjonen av DMSO i Tyrode-lasteoppløsningen er mindre enn 0,5%.
    5. Belys fiberen med en hvit lysemitterende diode (LED) og et filtersett med følgende bølgelengder for eksitasjon/dikroisk/emisjon: 450-490/510/515 nm (figur 3A).
      MERK: Alternative kilder til excitasjon inkluderer kvikksølv og xenon fluorescens lamper. Bruk lavest mulig intensitet og størrelse på eksitasjonspunktet for å unngå fotobleking av fargestoffet og skade på cellen.
    6. Fremkall fiberens Ca2+ respons (sarkoplasmatiske Ca2+ transienter) ved å påføre rektangulære strømpulser (0,8-1,2 ms) gjennom de to platinaelektrodene plassert langs hver side av eksperimentkammeret ved 20-22 ° C.
    7. Samle inn og lagre lyssignalene med et oljenedsenking 40x langdistanseobjektiv egnet for fluorescens og et fotomultiplikatorrør (PMT) koblet til en digitaliserer (figur 3A og tilleggsvideo S6). Sikre en skala i innsamlingsprogramvaren på 0-200 vilkårlige enheter (AU) og sett hvilefluorescensen (F-resten) av eksperimentet til 10 AU på den skalaen ved å modulere størrelsen på eksitasjonspunktet og forsterkningen av PMT. Når prosedyren er standardisert, hold forsterkningen uendret fra det ene eksperimentet til det andre og sett skalaen bare gjennom mindre justeringer i spotstørrelsen.
      MERK: Hvis bevegelsesartefakter oppstår, bruk 20-30 μM N-benzyl-p-toluensulfonamid (BTS) i Tyrode-løsningen.
    8. Analyser og kalibrer signalene som følger:
      1. Lowpass filtrerer hele sporet ved 1 kHz.
      2. Beregn F-resten i 1 s av sporet, juster F-hvilen til 0, og mål toppsarkoplasmatisk Ca2+ transienter ' amplitude (F-topp). Presenter amplituden som i ligning (1):
        Equation 1(1)
      3. Beregn maksimal Ca2+ konsentrasjon ([Ca2+], μM) ved hjelp av ligning (2) 26 og følgende parametere: in situ dissosiasjonskonstant (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maksimal fluorescens (Fmaks) på 150,9 AU, minimum fluorescens (Fmin) på 0,14 AU, Mag-Fluo-4 konsentrasjon [D] T på 229,1 μM26. F-topp ble allerede oppnådd i trinn 4.1.8.2.
        Equation 2(2)
      4. Mål stigningstiden fra 10% til 90% av amplituden (RT, ms), varigheten ved halv maksimum (HW, ms) og forfallstiden fra 90% til 10% av amplituden (DT, ms). Deretter estimerer du henfallskinetikken i henhold til en tilpasning med bieksponentialfunksjonen (ligning 3):
        Equation 3(3)
      5. Lagre verdiene for tidskonstantene for forfall τ1 og τ2 (ms) og amplitudene A1 og A226.
  2. Morfometriske målinger
    1. Monter et rent glassglass på det eksperimentelle badkammeret. Belegg lysbildet med 2-3 μL laminin og la det tørke i 30 s før du heller ~400 μL av fibersuspensjonen på lysbildet. La fibrene feste seg til laminininet i 10-15 minutter ved romtemperatur.
    2. Fremkall enkle rykninger for å verifisere levedyktigheten til fibrene ved å bruke rektangulære strømpulser (0,8-1,2 ms) gjennom de to platinaelektrodene plassert langs hver side av eksperimentkammeret. Selv når den er festet til laminin, er sammentrekningen av fibrene fortsatt synlig hovedsakelig i ytterpunktene.
    3. Ta bilder av levende fibre ved hjelp av 10x og 20x mål og et kamera på minst 5 megapiksler montert på et invertert fluorescensmikroskop. Lagre bildene i . TIFF-format for offline analyser.
      MERK: Et sett med ~ 2-6 bilder kan være nødvendig for å fullstendig fange en lang fiber.
    4. Se for deg en mikroskopmikrometerkalibreringslinjal under samme forstørrelse. Lagre bildene i . TIFF-format for offline analyser.
    5. Mål lengdene og diametrene på fibrene ved hjelp av kalibreringsverktøyet til fri programvare for bildeanalyser som følger:
      1. Opprett en relasjon mellom piksler og den kjente avstanden (μm) i bildene ved hjelp av mikroskopmikrometerkalibreringslinjalen ved hjelp av skaleringsverktøyet Analyser/angi som vist i tilleggsfigur S1.
      2. Mål lengder en gang fra den ene spissen til den andre av fiberen og diametrene på 2-6 forskjellige steder langs fiberen (1-2 målinger per bilde, avhengig av lengden), som i tilleggsfigur S1.
      3. Rapporter verdien av lengde (μm eller mm) og gjennomsnittet av alle diametre (μm) målt per fiber.
  3. Myosin tunge kjedeekspresjonsstudier
    MERK: For detaljer om bestemmelse av MHC ved immunfluorescens43 og natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)33,44,45,46 i hele muskler, se tilleggsfil 1. Protokollen for fibertyping ved immunfluorescensbestemmelse av MHC i suspensjonen av FDB-isolerte fibre er som følger:
    1. Belegg hver av fem rene glassglass med 2-3 μL laminin og la det tørke i 30 s før du heller ~300 μL fibersuspensjonen på hvert lysbilde. La fibrene feste seg til laminin i 4 timer ved romtemperatur.
    2. Fest preparatene med frysekjølt aceton i 30 minutter ved romtemperatur.
    3. Vask forsiktig 3x med PBS.
    4. Permeabiliser cellemembranene med PBS supplert med 0,7% Triton X-100 i 15 minutter ved romtemperatur.
    5. Vask forsiktig 3x med PBS supplert med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,04% Triton X-100, og blokker deretter med PBS med 2% BSA, 2% geitserum og 0,4% Triton X-100 i 30 min ved romtemperatur.
    6. Vask forsiktig 3x med PBS supplert med 0,2% BSA og 0,04% Triton X-100 og inkuber med de primære antistoffene som følger:
      1. Fortynn hvert anti-MHC primære antistoff i et separat hetteglass i PBS med 1% BSA og 0,04% Triton X-100: anti-I (1:1,500), anti-II (1:600), anti-IIA (bruk hele betingede medier fra hybridoma) og anti-IIB (1:500).
      2. Inkuber hvert lysbilde med ett antistoff og gjenværende lysbilde med PBS som kontroll i 12-16 timer ved 4 °C.
        MERK: I denne protokollen forble fibre type IIX umerket i alle prøver.
    7. Vask forsiktig 3x med PBS og inkuber alle lysbildene med det sekundære antistoffet (1:800) koblet til et fluorescerende grønt molekyl i 1-2 timer ved romtemperatur.
    8. Beiskjerner med 1 μg/ml Hoechst i 15 min.
    9. Vask forsiktig 3x med PBS, tilsett forsiktig 20-40 μL monteringsmedium, og legg et deksel.
      MERK: Skånsom løsningsutveksling og vask sikrer at dusinvis av fibre forblir festet til lysbildet, noe som gjør eksperimentet statistisk forsvarlig.
    10. Visualiser hvert lysbilde ved hjelp av et 10x objektiv som er egnet for fluorescens og et filtersett med følgende bølgelengder for eksitasjon / dikroisk / utslipp: 450-490 / 510 / 515 nm og telle alle positive og negative fibre. Alternativt kan du skaffe fluorescensbilder ved å bruke de samme tekniske forholdene og et kamera på minst 5 megapiksler montert på et invertert fluorescensmikroskop og lagre dem i . TIFF-format for offline analyser.
    11. Ta opp de positive og negative fibrene i hvert lysbilde i en database og beregne prosentandelen av positive I-, IIA-, IIB- og totale II-fibre basert på det totale antall fibre som er tilstede i det tilsvarende lysbildet. Beregn prosentandelen IIX-fibre ved å trekke summen av IIA + IIB fra prosentandelen av totale II-fibre. Beregn prosentandelen av hybrid I / IIA-fibre ved å trekke summen av I + II fra en verdi på 100%. Til slutt trekker du prosentandelen hybridceller fra summen av I og II for å ha de rene type I- og II-fibrene.
      MERK: I MHC-sammensetningsstudier er fibertyper betegnet med et stort brev mens isoformer er betegnet med små bokstaver46.
  4. Farging av hematoksylin og eosin
    1. Belegg en ren glasssklie med 2-3 μL laminin og la den tørke i 30 s før du heller ~300 μL fibersuspensjonen på lysbildet. La fibrene feste seg til laminin i 4 timer ved romtemperatur.
    2. Fest preparatet med Carnoys løsning (60% absolutt etanol, 30% kloroform, 10% eddiksyre) i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Inkubere med hematoksylin i 90 s.
    4. Vask forsiktig 3x med vann fra springen.
    5. Inkuber med 1% eosin Y fremstilt i 70% etanol i 30 s.
    6. Vask forsiktig 3x med vann fra springen.
    7. Fordyp 3x i absolutt etanol.
    8. Inkubere i xylol i 60 s.
    9. Legg til 20-40 μL monteringsmedium og visualiser med et konvensjonelt mikroskop. Skaff bilder ved ønsket forstørrelse ved hjelp av et fargekamera på minst 5 megapiksler.

5. Statistiske analyser og grafer

MERK: Den eksperimentelle enheten er en muskelfiber.

  1. Uttrykke resultater som gjennomsnitt ± standardavvik og beregne konfidensintervaller 95 % (KI95 %) for noen analyser.
  2. For å sammenligne lengde, diameter og Ca2+ transienters kinetikk mellom grupper, utfør variansanalyse (ANOVA) og post-hoc tester med korreksjon av Bonferroni.
  3. Vurder normalitet og varianslikestilling ved hjelp av henholdsvis Shapiro-Wilk og Levenes tester.
  4. Vurder forskjellene signifikante når p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sarkoplasmatisk Ca2+ konsentrasjon under en rykning
For å demonstrere muligheten for fysiologiske eksperimenter i settet av dissosierte fibre og for å utvide våre tidligere funn om eksitasjon-kontraksjonskobling (ECC) og fibertyper, ble Ca2 + transienter anskaffet i fibre fra alle muskler. Først viste FDB (n = 5) og EDL (n = 7) Ca2+ kinetikk kjent som morfologi type II (MT-II). Dette er raske, piggete signaler, hvis RT varer ~ 1 ms; dens forfallsfase kan utstyres med en bieksponentiell funksjon med den første komponenten (A1) større enn 30% av hele amplituden, og dens topp [Ca2+] er mellom 15 og 30 μM33,47 (figur 3B). Resultatene er slått sammen (n = 12) i første kolonne i tabell 1, mens resultatene fra soleus' Ca2+-transienter (n = 6) er presentert i andre kolonne i tabell 1. Soleus' signaler ble klassifisert som morfologi type I (MT-I, figur 3B) -bredere, med en RT over 1,2 ms, en A1 lavere enn 30%, og en topp [Ca2+] mellom 7 og 13 μM33,47. Disse to kolonnene ble ansett som referanser for å sammenligne Ca2+-transientene til de nye musklene. Siden alle fibre fra PDQA (n = 4), PL (n = 6) og EHL (n = 4) delte MT-II (figur 3B), er dataene samlet (n = 14) i tredje kolonne i tabell 1. Disse signalene viste en gjennomsnittlig RT på ~1 ms, en A1 på ~45%, en topp [Ca2+] over 15 μM, og sammenligner veldig godt med resultatene presentert i den første kolonnen, men skiller seg klart fra de som er vist i den andre kolonnen, som bekreftet av den statistiske analysen (tabell 1). Det raskeste signalet fra hele prøven kom fra en EHL-fiber, med en ΔF / F på 0,66, [Ca2+] på 16,99 μM, RT på 0,85 ms, HW på 2,42 ms og DT på 10,56 ms. τ1 og τ2 var henholdsvis 1,63 og 7,21 ms, mens A1 og A2-verdier var 56,60% og 43,40%. Det tregeste signalet kom fra en soleusfiber, med en ΔF / F på 0,41, [Ca2+] på 9,76 μM, RT på 1,56 ms, HW på 9,43 ms og DT på 31,88 ms. τ1 og τ2 var henholdsvis 2,81 og 96,42 ms, mens A1 og A2-verdier var 19,55% og 80,45%. 

Et batteri av korte, mellomliggende og lange fibre
Observasjonen av klare forskjeller mellom fibrene i henhold til muskelkilden muliggjorde en mer fullstendig morfometrisk karakterisering. Histogrammene i figur 4 viser påfallende variasjoner i fibrenes lengder over alle muskler. Dette fremheves når man sammenligner den korteste fiberen fra FDB (227,06 μm) med den lengste fra soleus (5,69 mm). Gjennomsnittslengdeverdiene er oppsummert i tabell 2. Det var signifikante statistiske forskjeller mellom gruppene (p < 0,01). Disse resultatene tillater klassifisering av FDB-fibre som korte (<1 mm); PDQA og PL som mellomliggende (1 til 3 mm); og EDL, EHL og soleus så lange (>3 mm) (tilleggsfigur S2).

Omvendt ble det observert mindre forskjeller i gjennomsnittlig diameter av fibrene i alle muskler (tabell 2) og fordelingen av verdiene (figur 4). Likevel var det signifikante statistiske forskjeller mellom gruppene (p < 0,01). Når det ble evaluert i detalj, var det forskjeller mellom FDB og hverandre muskler og mellom FDB (FDB 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) og poolen av mellomliggende og lange fibre (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). Den tynneste cellen i hele prøven målte 18,42 μm (FDB) og den tykkeste nådde 82,79 μm (PDQA).

Fibertyper brukt i fysiologiske eksperimenter
Først ble fibertyper tilstede i hver hel muskel bestemt av immunfluorescens. Bortsett fra soleus viste musklene en overvekt på over 76% av type II-fibrene (tilleggsfigur S3, tabell 3 og tabell 4). EHL, PL og PDQA er spesielt raske muskler, med over 90% av raske fibre og opptil 58,8% av type IIB-fibre, som funnet i PDQA. EHL og PDQA var praktisk talt uten type I-fibre. Hybrid I / IIA-fibre var tilstede i alle muskler i lave prosenter. Som forventet utgjorde type I- og IIA-fibre over 82% av de totale fibrene i soleus. Denne muskelen er nesten blottet for de raskeste IIB-fibrene. Ifølge profilen av fibertyper er soleus den tregeste og PDQA er den raskeste muskelen av de seks analyserte.

Deretter, og fordi det er mer relevant for enkeltfiberfysiologiske eksperimenter, ble spørsmålet om hvilke typer fibre som forekommer i cellesuspensjonen avledet fra dissociert FDB adressert. Det ble funnet at profilen av fibre i cellesuspensjonen reflekterer sammensetningen av fibre tilstede i kryoseksjonene: tre av fire dissosierte fibre var type II (figur 5 og tabell 3).

Til slutt ble sammensetningen av musklene bekreftet ved å separere deres MHC-isoformer gjennom SDS-PAGE. Resultatene var i samsvar med det generelle mønsteret observert i immunfluorescensanalysene. Soleus ble anriket i MHC IIa og I, mens EDL, EHL og peronei ble anriket i MHC IIx og IIb, men var blottet for I (tilleggsfigur S4).

Figure 1
Figur 1: Studiens utforming. (A) Utstyr og løsninger som må settes opp før disseksjonsprosedyren påbegynnes. 1. Stereoskop nummer én. 2. Fra bunn til topp: et sett med fem brannpolerte pipetter, disseksjonsverktøy og kollagenase-hetteglass inne i en bærbar kjøler (gult etui). 3. Filterveske, disseksjonskammer, hetteglass av merket glass med kork, stativ med filtrerte løsninger. 4. Disseksjon verktøy. 5. Stereoskop med disseksjonskammer nummer to koblet til et kamera og en elektrisk stimulator. (B) Disseksjonsprosedyren for settet med seks baklemmemuskler hos mus som nærmere forklart i figur 2. (C) Etter disseksjon må muskelkontraksjon og integritet verifiseres før du fortsetter til neste protokolltrinn. Den venstre muskelen i venstre panel viser en bølgete, hyperkontrahert, ikke-responsiv PL-muskel (blå pil), som ikke skal brukes til å oppnå dissosierte fibre. I stedet må disseksjonsprotokollen optimaliseres og startes på nytt. Den godt dissekerte PL-motparten (høyre muskel i venstre panel) viser et langstrakt utseende og trekker seg synlig sammen (Supplemental Video S1). Panelet til høyre viser to EDL (blå pil) og to FDB-muskler i kollagenaseløsningen med korrekt, rett utseende. (D) Når musklene er dissosiert, hell de isolerte fibrene inn i eksperimentkammeret og kontroller deres sammentrekning og integritet. På venstre panel, levende (blå pil) og døde PL-fibre. På høyre panel, levende (blå pil) og døde EDL-fibre. (VG Nett) Tre sett med eksperimenter ble utført med de isolerte fibrene: (E) Sarkoplasmatiske Ca2+ konsentrasjonsmålinger under en rykning (resultater i figur 3). (F) Morfometriske analyser (resultater presentert i figur 4). Dette eksemplet viser en PL-fiber. (G) Immunfluorescens for myosin tunge kjedeekspresjonsstudier (resultater illustrert i figur 5). Dette eksemplet viser en isolert FDB-fiber. Vektstenger = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Anatomiske referanser og generell prosedyre for å dissekere settet med seks bakkroppsmuskler i musen. Rader, fra topp til bunn, presenterer musklene i henhold til den beste rekkefølgen av disseksjon: FDB, soleus, EDL, EHL, PL og PDQA. Kolonner, fra venstre mot høyre, presenterer milepælene under disseksjon. Den første kolonnen viser musklene eller deres distale sener eksponert slik at disseksjonen kan starte. For eksempel peker blå piler på FDB og soleus in situ og til de distale senene til EDL. De følgende to søylene illustrerer selve disseksjonen og musklene som eksponeres etter at distal(e) senen(e) er kuttet, som for eksempel merket med den blå pilen i EDL-raden. Det anbefales at grenen av FDB rettet mot det femte sifferet fjernes. Kolonnen lengst til høyre presenterer musklene når de er helt fjernet, med de proksimale senene orientert mot den øvre delen av bildene. Blå, diskontinuerlige linjer (ekstrem høyre kolonne) illustrerer de langsgående eller diagonale kuttene som må utføres i soleus- og EDL-musklene for å sikre at kollagenasen kommer inn i bulk. Skalastenger = 5 mm. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ca2+ transienter registrert i fibre hentet fra et sett med seks baklemmer muskler i mus. (A) Oppsett som brukes til anskaffelse av Ca2+ -transienter under dempet belysning. Venstre panel: 1. PMT koblet til et invertert fluorescensmikroskop (2). 3. Kamera koblet til mikroskopet. 4. Elektrisk stimulator koblet til eksperimentkammeret. 5. Mikromanipulasjonssystemet kan brukes når elektrofysiologi og injeksjonsanalyser er planlagt for å komplementere Ca2+ transientoppkjøpet. Midtpanel: Det eksperimentelle kammeret (innsatsen) med de lastede cellene er montert på mikroskopets scene og opplyst med blått lys (450-490 nm, blå pil) for å opphisse fargestoffet. I dette oppsettet plasseres elementene 1 til 5 over et antivibrasjonsbord og inne i et Faradays bur. Høyre panel: Når kvaliteten på sammentrekning og fargestoffbelastning er verifisert med kameraet (6), rettes lyset som sendes ut til PMT, den elektriske stimuleringen starter, og signalet mates til digitalisatoren (7) og til innsamlingsprogramvaren (8) for å registrere Ca2+ -transienten. Den integrerte funksjonen til disse elementene under et live eksperiment kan sees i Supplemental Video S6. (B) Representative, kalibrerte Ca2+ transienter av FDB, PDQA, PL, EDL, EHL og soleus fibre i mus. De lignende, raske, smale signalene til FDB, PDQA, PL, EDL og EHL bekrefter at de allerede har MT-II kjent for å stamme fra IIX- og IIB-fibre, som er de mest tallrike i disse musklene. I kontrast er soleustransienten langsommere og mindre, typisk for MT-I, opprinnelig beskrevet i I- og IIA-fibre. Den røde kurven over EDL- og soleussignalene viser at nedbrytningsfasen til MT-I og MT-II kan utstyres med en bieksponentiell henfallsfunksjon. Kalibreringsstenger gjelder for alle paneler. Vertikal stang = 2,5 μM av [Ca2+], horisontal stang = 10 ms. Fargetasten nederst hjelper til med å identifisere musklene. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PMT = fotomultiplikator rør; MT-I = morfologi type I; MT-II = morfologi type II. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Morfometriske målinger av de korte, mellomliggende og lange fibrene oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av settet med seks bakkroppsmuskler i musen. Intakte, sunne, representative fibre fra hver muskel er avbildet i kolonnepanelene lengst til venstre. Bildene ble kun redigert for å redusere bakgrunnsstøy og øke kontrasten, uten direkte manipulering av muskelfibrene. Skalastenger = 100 μm (alle paneler). Måleprotokollen, samt utseendet og kvaliteten på de komplette langfibrene, kan ses nærmere i tilleggsfigur S1. Midterste kolonne viser fordelingen av lengder, bestilt fra muskelen som gjenga de korteste fibrene (FDB), til den med de lengste fibrene (soleus). Det er et kontinuum av lengder slik at det er noe overlapping mellom musklene, som spenner over totalt ~ 5,5 mm. Diameterfordelinger er presentert i kolonnepanelene lengst til høyre. De fleste fibre er mellom 30 og 60 μm, med små forskjeller mellom muskler. Test-retest-analyser (n = 78 fibre, tilsvarende 9,85 % av hele utvalget av n = 792) av de morfometriske målingene viste svært høy reproduserbarhet (gjennomsnittlig variasjonskoeffisient på 1,77 % – konfidensintervall 95 %, KI95 %, 1,26-2,27 % – gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient på 0,99 (KI 95 % 0,98-0,99)), noe som fremhever den gode påliteligheten av resultatene. Gaussiske distribusjonskurver ble lagt til med grafisk lisensiert programvare. Tilleggsfigur S2 viser søylediagrammer av middelverdiene for lengde og diameter og sammenslåingene av lengde- og diameterfordelinger av alle muskler for enklere sammenligning. Fargetast nederst hjelper til med å identifisere musklene. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL, = extensor hallucis longus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Immunfluorescensanalyser for fibertyper i cellesuspensjonen i dissosierte FDB-muskler. Bilder av forskjellige felt viser intakte, dissosierte FDB-fibre festet til bunnen av lysbildene. (A) En antimyosin II-positiv fiber (grønn fluorescens, diagonal lyseblå pil) står tydelig i kontrast til en negativ (lyseblå pilspiss), noe som demonstrerer diskrimineringskraften til analysen. Tilstedeværelsen av begge fibrene i bildet kan bekreftes på grunn av merking av kjernene (blå fluorescens). (B) Et annet felt viser en annen antimyosin II-positiv fiber. (C) Korrekt identifisering av den myosintunge kjeden i A-båndene (grønn fluorescens) av antistoffene ble bekreftet ved hjelp av konfokalmikroskopi. De mest beryktede transversale svarte stripene tilsvarer I-båndene, beriket i aktin, og forventes derfor ikke å bli gjenkjent av antistoffene. (D) Hematoksylinetiketter i lilla de typiske perifere, rikelig kjerner og eosin merker sarkoplasma av fiberen, som viser en intakt, moden celle. Skalastenger = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fibre FDB og EDL Soleus PDQA, PL og EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0,68±0,15 0,46±0,06*,† 0,66±0,12 <0,01
[Ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0,01
RT (ms) 0,95±0,10 1,26±0,20*,† 0,95±0,09 <0,01
Stigningshelling (F/ms) 5.97±1.41 3,12±0,79*,† 5,83±0,97 <0,01
HW (ms) 3.59±0.85 8,17±3,00*,† 3.19±0.54 <0,01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0,01
Forfallshelling (F/ms) -0,24±0,07 -0,10±0,03*,† -0,35±0,08* <0,01
τ1 (ms) 1,86±0,37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0,05
τ2 (ms) 11.50±3.93 46,38±27,14*,† 8.29±2.14 <0,01
A1 (%) 48.14±7.27 25,94±8,98*,† 44.59±8.29 <0,01
A2 (%) 51.86±7.27 74,06±8,98*,† 55.41±8.29 <0,01
Morfologi MT-II MT-I MT-II

Tabell 1: Ca2+ transienters kinetikk i enzymatisk dissosierte fibre oppnådd fra et sett med seks bakkroppsmuskler i mus. Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik. p-verdier tilsvarer Analyse av varianstest. *Vesentlig forskjellig fra FDB- og EDL-gruppene. †Vesentlig forskjellig fra PDQA-, PL- og EHL-gruppene. Forkortelser: F = fluorescens; [Ca2+] = cytosolisk topp Ca2+ konsentrasjon; RT = stigetid; HW = varighet ved halv maksimum; DT = forfallstid; τ1 og τ2 = tidskonstanter av forfall; A1 og A2 = amplituder av forfall; FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MT-I = morfologi type I; MT-II = morfologi type II.

Fibre FDB PDQA PL EDL EHL Soleus p
n 370 142 80 70 87 43
Lengde (mm) 0,42±0,05* 2,20±0,26** 2,69±0,26† 3,51±0,53†† 3,83±0,44‡ 4.62±0.64 <0,01
Diameter (μm) 38,40±9,40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0,01

Tabell 2: Morfometriske målinger av de korte, mellomliggende og lange fibrene oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av settet med seks bakkroppsmuskler i musen. Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik. p-verdier tilsvarer Analyse av varianstest. *Statistisk forskjellig fra PDQA, PL, EDL, EHL og soleus. **Vesentlig forskjellig fra PL, EDL, EHL og Soleus. †Vesentlig forskjellig fra EDL, EHL og soleus. ††Vesentlig forskjellig fra EHL og soleus. ‡Vesentlig forskjellig fra soleus. Vesentlig forskjellig fra EHL. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Muskler / fibre N n Totaltype I + I/IIA (%) Total type II (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

Tabell 3: Fibertyper i kryoseksjoner og i cellesuspensjon i dissosierte FDB-musmuskler. Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik. N refererer til antall dyr, mens n refererer til det totale antall fibre analysert i forsøkene. FDB-raden presenterer data for hele muskelen som bestemt i kryoseksjoner, mens *FDB-raden tilsvarer isolerte fibre i cellesuspensjonen etter dissosiering av muskelen. Kolonnen "Total type II" reflekterer rene fibre type IIA, IIX og IIB. Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis.

Muskel N n Type I (%) Type I/IIA (%) Type IIA (%) Type IIX (%) Type IIB (%) Total type II (%)
PDQA 4 597 0,00±0,00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35.85±5.66 35.66±9.36 94.52±3.90
EDL 4 826 0,00±0,00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89.56±8.33
EHL 5 618 0,24±0,76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
Soleus 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

Tabell 4: Fibertyper i kryoseksjoner av musklene som gir mellomliggende og lange musfibre. Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik. N refererer til antall dyr, mens n refererer til det totale antall fibre analysert i forsøkene. Alle rader presenterer data for hele muskelen som bestemt i kryoseksjoner. Type I-, IIA-, IIX- og IIB-kolonnene reflekterer rene fibre, mens I / IIA-kolonnen refererer til hybridfibre. Kolonnen "Total type II" er summeringen av kolonnene type IIA, IIX og IIB. Forkortelser: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Tilleggsfil 1: Myosin tunge kjedeuttrykksstudier i hele muskler. Protokollene presenterer detaljer for bestemmelse av myosin tungkjedeisoformer ved immunfluorescens i kryoseksjoner og ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese i homogenater av hele muskler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S1: Detaljer om morfologien til fibrene oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av settet med seks musmuskler i bakbenet. (A) Kalibreringslinjalen for mikroskopmikrometer som er åpen for å stille inn skalaen i programvaren for bildeanalyse, vises til venstre. Det høyre panelet viser hvordan diameteren gjentatte ganger ble målt som indikert av de blå linjene vinkelrett på fiberens lange akse (blå piler), mens lengden ble målt en gang fra spiss til spiss som illustrert av den blå linjen langs fiberens hovedakse. (B) Flere bilder ble satt sammen med mindre redigering for å demonstrere det lange og sunne utseendet til PDQA-, PL-, EDL-, EHL- og soleusfibre (små blå, grønne, gule, oransje og rosa innlegg). De sammensatte bildene ble ytterligere redigert for å gi fibrene et bedre utseende (store, svarte og hvite bilder). (C) DIC-bilder av FDB-, PDQA-, PL- og soleusfibre som fremhever den normale uregelmessigheten i spissen og deres velkjente tverrgående striper. DIC-utseendet til de gjenværende EDL- og EHL-fibrene kan sees i Supplemental Video S3 og Supplemental Video S4. Skalastenger = 100 μm. Fargetasten nederst hjelper til med å identifisere musklene. Forkortelser: FDB, flexor digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, extensor digitorum longus; EHL, ekstensor hallucis longus; DIC = Differensiell interferenskontrast. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: Barplott og sammenslåtte lengde- og diameterfordelinger av fibrene oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av settet med seks bakkroppsmuskler i musen. (A) Søylediagrammer (gjennomsnittlig ± standardavvik) og (B) sammenslåtte histogrammer bekrefter forskjellen i lengdene, men likheten av diametrene på tvers av alle grupper. *Vesentlig forskjellig fra PDQA, PL, EDL, EHL og Soleus. **Vesentlig forskjellig fra PL, EDL, EHL og Soleus. †Vesentlig forskjellig fra EDL, EHL og soleus. ††Vesentlig forskjellig fra EHL og soleus. ‡Vesentlig forskjellig fra soleus. Vesentlig forskjellig fra EHL. Fargetasten nederst hjelper til med å identifisere musklene. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S3: Immunfluorescensstudier for fibertypesammensetning av settet med seks bakkroppsmuskler i musen. Representative antistoffmerkede kryoseksjoner som brukes til analysene viser prøvenes gode kvalitet og intakthet. Det er en klar overvekt av fiber type II i alle muskler, bortsett fra soleus hvor mengden fiber type I er stor. Skalastenger = 100 μm. Fargetasten nederst hjelper til med å identifisere musklene. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S4: Elektroforetisk separasjon av MHC-isoformer i settet med seks bakkroppsmuskler i musen. (A) To representative komplette geler som kjøres på forskjellige dager med forskjellige prøver, demonstrerer kvaliteten, renheten og reproduserbarheten av separasjons- og migrasjonsavstanden til MHC-isoformene når de er farget med Coomassie-blå. Selv om disse to bildene ble litt redigert for å forbedre kontrast og klarhet for leseren, ble analysene utført i uredigerte geler. (B) Eksempler på analyser av båndene for hver av de seks musklene. Etter at en avkastning er valgt i gelens baner, genereres en plotprofil og en gaussisk passform brukes til å estimere andelen MHC-isoformer i settet med seks muskler. MHC-sammensetningen som ble funnet var: FDB: I 9,0 ± 5,0%, IIa + IIx 91,0 ± 5,0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4 %, IIb 74,1 ± 2,4 % (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2 %, IIb 75,1 ± 2,2 % (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3%, IIb 78,0 ± 2,3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0 %, IIb 72,5 ± 1,0 % (n = 3); soleus: I 35,8 ± 2,5%, IIa (+IIx + IIb når tilstede) 64,2 ± 2,5% (n = 4). Fargetasten nederst hjelper til med å identifisere musklene. Det grå rektangelet under gelen lengst til høyre i A refererer til molekylvektmarkøren som indikerer migrasjonen av IIa til ~ 200 KDa. Forkortelser: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MHC = myosin tung kjede; ROI = interesseområde. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo S1: Den skadede, bølgete, peroneus longus (PL, venstre) trekker seg ikke sammen ved stimulering, mens den intakte PL (høyre) trekker seg godt sammen, selv når den er lenger fra elektrodene. 0,8x forstørrelse. Stimuleringsprotokollen frigjør rektangulære strømpulser på 1,2 ms, 0,7 Hz og 50 V gjennom to elektroder. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S2: Kontrahering peroneus longus fiber. 20x forstørrelse. Differensiell interferenskontrastmodus. Stimuleringsprotokollen frigjør rektangulære strømpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gjennom to platinaelektroder. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S3: Kontraherende extensor digitorum longus fiber. 20x forstørrelse. Differensiell interferenskontrastmodus. Stimuleringsprotokollen frigjør rektangulære strømpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gjennom to platinaelektroder. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S4: Kontraherende extensor hallucis longus fiber. 20x forstørrelse. Differensiell interferenskontrastmodus. Stimuleringsprotokollen frigjør rektangulære strømpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gjennom to platinaelektroder. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S5. Kontrahering soleus fiber. 20x forstørrelse. Differensiell interferenskontrastmodus. Stimuleringsprotokollen frigjør rektangulære strømpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V, gjennom to platinaelektroder. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S6: Liveopptak av en Ca2+ transient fra en extensor digitorum longus fiber lastet med Mag-Fluo-4, AM som beskrevet i trinn 4.1.4. Stimuleringsprotokollen frigjør rektangulære strømpulser på 1,2 ms, 0,5 Hz og 50 V gjennom to platinaelektroder. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å utfylle modellene som er tilgjengelige for å studere moden skjelettmuskulaturbiologi, demonstrerer vi her den vellykkede enzymatiske dissosiasjonen av en rekke musemuskler med korte, mellomliggende og lange fibre. Disse fibrene tillater demonstrasjon av generaliserbarheten av MT-II-kinetikken til Ca2+ -transientene i skjelettmuskulatur. Videre ble fibertypene i de intakte, hele musklene klassifisert. Gitt at FDB er den mest brukte muskelen for fysiologiske eksperimenter, ble de typer fibre som er tilstede i cellesuspensjonen etter dissosiasjon vurdert.

Et batteri av korte, mellomliggende og lange intakte fibre for muskelbiologiske studier
Disseksjonsteknikken, varigheten av den enzymatiske behandlingen, typen enzym som brukes og tritureringsprosedyren er kritiske trinn i protokollen for å oppnå intakte enzymatisk dissosierte fibre. Disseksjonen må gjøres så raskt som mulig for å redusere tiden under hypoksi samtidig som man unngår unødvendig strekking. Det siste punktet er spesielt relevant for soleus, som ikke må fjernes ved å trekke opp gastrocnemius-soleus-komplekset. Videre skader en omfattende enzymatisk behandling (~ 3 timer) 20,48 og dårlige triturasjonsprosedyrer (f.eks. hard, lav erfaring fra forskeren) cellene, som bekreftet empirisk i flere laboratorier. Kollagenase type 2 anbefales fremfor andre kollagenasetyper. Dannelsen av bobler under triturering må unngås, og enten musklene eller fibrene må bare manipuleres med glasspipetter i stedet for plastpipettespisser. Bruk av glassflasker foretrekkes under hele prosedyren fremfor plast, koniske hetteglass, fordi den første gir mer synlighet, kan plasseres oppover på stereoskopet for en toppvisning av muskelen når den er i løsningene, gir mer plass til triturering av musklene lengre og bulkere enn FDB, og er motstandsdyktige mot riper forårsaket av glass Pasteur-pipetter. Siden alder, vekt og metabolsk tilstand (f.eks. sunn vs. fettrik fedme) påvirker effektiviteten av metoden, kan flere parametere trenge optimalisering når du arbeider med dyr utenfor området som brukes i dette manuskriptet. Det er viktig at en mild eksponering av en muskel til visse enzymer som de som brukes her og en korrekt dissosiasjonsprosedyre, ikke påvirker fibrene funksjonelt, som vist ved bevis samlet i flere tiår av flere grupper, hvorav noen ble oppsummert for noen år siden49. Dette støttes ytterligere av det faktum at toppen [Ca2+] målt med raske Ca2+ fargestoffer under en rykning oppnådd i manuelt dissekerte bunter og enzymatisk dissosierte fibre av mus kan betraktes som sammenlignbare (gjennomgått i 47).

Selv om det finnes andre modeller for muskelbiologiske studier, som C2C12 myotuber, normale og muterte humane myoblastcellelinjer, eller pluripotente stamceller (iPSC) -avledede fibre 31,39,50,51,52,53, er de umodne og diskuteres ikke her. Permeabiliserte eller flådde fibre er også informative, velkarakteriserte modeller54,55, men de er ikke intakte. Modellen av manuelt isolerte fibre gir flere fordeler som presentert andre steder:20, men har lav effektivitet og krever høy trening. Disse fakta fremhever at modellen av interesse her - fibre oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon - gir mulighet for å oppnå intakte, rikelige, modne skjelettmuskelfibre av forskjellige typer. En begrensning ved modellen er imidlertid at mangelen på sener begrenser den direkte vurderingen av kontraktile egenskaper i de isolerte fibrene.

Gitt at lengden på fibrene ikke er den samme som lengden på musklene14,42 og at fibrene er eksperimentenheten, er det mer relevant å klassifisere lengden på fibrene, ikke av musklene. Gitt våre resultater og deres potensielle eksperimentelle implikasjoner, kan FDB-fibrene klassifiseres som korte (<1 mm); PDQA og PL som mellomliggende (1 til 3 mm); og EDL, EHL og soleus så lange (>3 mm). Korte fibre er de enkleste og mest tallrike oppnådd (~ 400-500 fibre per mus) og er egnet for fluorescensmikroskopieksperimenter der festingen av fiberen til bunnkammeret er nøkkelen, eller når bevegelsesartefakter må unngås (f.eks. Ca2+ transienter). Lange fibre er de vanskeligste å få tak i, har lavest gjengivelse, og er bedre for proteinuttrykk ved hjelp av separasjonsteknikker eller enkeltcelle molekylærbiologiske studier. Mellomfibre kan oppnås i en god mengde (~ 50 fibre per mus) etter moderat trening og er egnet for mange eksperimentelle tilnærminger, som vist for eksempel med Ca2+ transientenes eksperimenter. Å erkjenne at FDB, EDL og soleus har blitt brukt før, er dette det første arbeidet for å lykkes med å isolere fibre fra PDQA-, PL- og EHL-musklene, og dermed øke tilgjengeligheten av modeller for modne skjelettmuskelstudier. Videre sikrer innhenting av fibre fra forskjellige muskler at mer informasjon oppnås fra samme dyr, reduserer eksperimentell variabilitet, øker statistisk kraft og biologisk lydighet av konklusjonene, og reduserer antall dyr som brukes i eksperimenter.

Generaliserbarhet av Ca2+ transienters kinetikk
Ved analyse av kinetikken til Ca2+-transientene i pattedyrmodne skjelettmuskelfibre, har vi tidligere vist at fibre type I og IIA deler den såkalte morfologitypen I (MT-I), mens fibrene IIX og IIB deler MT-II-morfologien. Vanligvis har MT-II-signaler en RT på mindre enn 1,2 ms, DT på mindre enn 25 ms, A1 høyere enn 30%, [Ca2+] over 15 μM, og finnes lett i FDB- og EDL-fibre33,47. Etter å ha sammenlignet resultatene fra romanen Ca2+-transienter av PDQA, PL og EHL med de som finnes her og de som tidligere er publisert for FDB og EDL, er det enkelt å konkludere med at de alle også er MT-II. En ytterligere interessant observasjon er at å øke tilgjengeligheten av nye muskler beriket i fibre type IIX og IIB som modeller for å oppnå dissosierte fibre, gjør at man kan bekrefte at kinetikken til Ca2 + -transientene kan generaliseres - type IIX og IIB-fibre har MT-II uavhengig av deres kilde (dvs. fleksorer (FDB), ekstensorer (EDL og EHL), eller peronei (PDQA og PL)). Dette styrker ideen om et etablert gencellulært program eller profil av ECC-maskineriet, som er ganske likt innenfor alle fibre av samme type, og at forskjeller i molekylært maskineri (dvs. isoformer og proteinmengde) som ligger til grunn for genereringen av Ca2 + -transienter forklarer forskjellene i morfologier rapportert blant fibre33. Til slutt er en praktisk implikasjon at ved opptak med Mag-Fluo-4 Ca2+ transienten til en fiber, er det mulig å kjenne sin type på en pålitelig måte.

MHC-uttrykk i muskler og isolerte fibre: implikasjoner for typer fibre som brukes i fysiologiske eksperimenter
Å vite hvilken type fiber øker påliteligheten av muskelforskning. For eksempel, i knockoutmus av et hvilket som helst protein differensielt uttrykt i henhold til fibertyper, kan bruk av fibre fra FDB uten skriving føre til misvisende resultater. Våre data bekrefter at FDB er en blandet muskel med en overvekt av type IIX-fibre, i samsvar med tidligere artikler 25,31,56. Enda viktigere, det var et høyt samsvar mellom andelen fibertyper som var tilstede i hele muskelen og den som ble oppnådd etter dissosiasjon. Siden denne informasjonen er ny og vanligvis ikke diskuteres i papirer ved hjelp av FDB-fibre, kan det spekuleres i at mange resultater oppnådd i dissosierte FDB-fibre ved en tilfeldighet virkelig kan gjenspeile blandet informasjon om ~ 20-25% som kommer fra fibre type I og 75-80% fra type II. Fremtidige studier ved bruk av FDB-muskel bør presentere data og tilhørende diskusjon, i forhold til fibertyper.

Siden soleus er svært anriket i oksidativ type I, IIA og I / IIA fibre 57,58,59, er disse fibrene som finnes i suspensjonen etter dissosiasjon 33. EDL, en annen kjent muskel, er nesten blottet for type I-fibre57,58,59, og gir derfor bare raske fibre etter dissosiasjon33. Etter samme logikk og i henhold til skriveresultatene som viser anrikning av type II-fibre i de tre nye musklene, ytterligere støttet av det faktum at de få type I-fibrene som finnes i peronei-musmuskler er sentrale60 og ikke forventes å bli nådd under en mild dissosiasjon, hypoteser vi at sannsynligheten for å bruke en rask IIX- eller IIB-fiber i et eksperiment med dissosierte fibre av PDQA, PL, eller EHL kan være så høy som 80-90%. Dette ser ut til å være sant i henhold til Ca2+-transientdataene der ingen MT-I-signaler ble funnet. Gitt deres størrelse, gir disse fibrene fordelen av å være egnet for å skrive etter å ha fullført et funksjonelt eksperiment. Videre hjelper BTS spesifisitet for MHC II til å diskriminere mellom fibertyper mens du fjerner bevegelsesartefakter. Til slutt, mens denne fibermetoden var mer arbeidskrevende enn nylig beskrevet optimaliserte61,62, påvirket den ikke resultatene av det nåværende arbeidet.

Konklusjoner
De presenterte metodologiske detaljene kan fremme bruken av en rekke enzymatisk dissosierte muskelfibre i studiet av muskelbiologi. Allsidigheten til modellen støttes av muligheten for å få fibre innenfor et stort spekter av lengder og typer og deres bruk på tvers av flere eksperimentelle applikasjoner. Foruten FDB, EDL og soleus hvis dissosiasjon ble rapportert for mange år siden, demonstrerte vi muligheten for å skaffe mellomliggende og lange fibre fra andre muskler som PDQA, PL og EHL. Gitt hvor enkelt disseksjonen kan utføres og antall fibre som kan oppnås, samt homogeniteten og størrelsen på fibrene, foreslår vi PL som en rutinemessig, egnet modell for modne skjelettmuskelstudier. Dette støttes av våre funn om at kinetikken til Ca2+ -transientene i skjelettmuskulatur kan generaliseres uavhengig av kilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne uttrykker sin takknemlighet til professor Robinson Ramírez fra UdeA for hjelp med dyr og noen bilder og til Carolina Palacios for teknisk støtte. Johan Pineda fra Kaika hjalp oss med å sette opp farge- og fluorescenskameraene. Shyuan Ngo, fra University of Queensland, korrekturleste manuskriptet. Denne studien ble finansiert av CODI-UdeA (2020-34909 fra 22. februar 2021 og 2021-40170 fra 31. mars 2022, SIU), og Planning Office-UdeA (E01708-K og ES03180101), Medellín, Colombia, til JCC. Finansiører deltok ikke i datainnsamling og analyse, manusskriving eller innsending.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260 (2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14 (2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939 (2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898 (2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976 (2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118 (2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199 (2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807 (2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074 (2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961 (2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669 (2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796 (2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654 (2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126 (2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075 (2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Tags

Biologi utgave 202 skjelettmuskulatur muskelfibre fibertyper Ca2+ eksitasjon-kontraksjonskobling immunfluorescens myosin tungkjede
Intakte korte, mellomliggende og lange skjelettmuskelfibre oppnådd ved enzymatisk dissosiasjon av seks baklemmusmuskler hos mus: Utover flexor digitorum brevis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter