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Biology

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Abstract

Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von Mausmuskeln gewonnen werden, sind ein nützliches Modell für physiologische Experimente. Die meisten Arbeiten befassen sich jedoch mit den kurzen Fasern des Flexor digitorum brevis (FDB), was den Umfang der Ergebnisse einschränkt, die sich mit Fasertypen befassen, die Menge des verfügbaren biologischen Materials begrenzt und eine klare Verbindung zwischen zellphysiologischen Phänomenen und früheren biochemischen und dynamischen Erkenntnissen in anderen Muskeln verhindert.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie intakte Fasern aus sechs Muskeln mit unterschiedlichen Fasertypprofilen und -längen gewonnen werden können. Anhand von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zeigen wir das Muskeldissektions- und Faserisolationsprotokoll und demonstrieren die Eignung der Fasern für Ca2+ transiente Studien und ihre morphometrische Charakterisierung. Die faserartige Zusammensetzung der Muskeln wird ebenfalls vorgestellt. Bei der Dissoziation wurden alle Muskeln intakte, lebende Fasern, die sich länger als 24 Stunden schnell zusammenzogen. FDB ergab kurze (<1 mm), Peroneus digiti quarti (PDQA) und Peroneus longus (PL) ergaben intermediäre (1-3 mm), während Extensor digitorum longus (EDL), Extensor hallucis longus (EHL) und Soleus-Muskeln lange (3-6 mm) Fasern freisetzten.

Bei der Aufzeichnung mit dem schnellen Farbstoff Mag-Fluo-4 zeigten Ca2+ -Transienten von PDQA-, PL- und EHL-Fasern eine schnelle, schmale Kinetik, die an die Morphologie des Typs II (MT-II) erinnert, von der bekannt ist, dass sie den Fasern vom Typ IIX und IIB entspricht. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass diese Muskeln über 90% Typ-II-Fasern aufweisen, verglichen mit FDB (~80%) und Soleus (~65%). Über FDB hinaus zeigen wir zum ersten Mal die Dissoziation mehrerer Muskeln, die Fasern ergeben, die einen Längenbereich zwischen 1 und 6 mm umfassen. Diese Fasern sind lebensfähig und liefern schnelle Ca2+ -Transienten, was darauf hindeutet, dass das MT-II unabhängig von ihrer Muskelquelle auf IIX- und IIB-Fast-Fasern verallgemeinert werden kann. Diese Ergebnisse erhöhen die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur.

Introduction

Der reife Skelettmuskel von Säugetieren ist ein multifunktionales Gewebe. Es reguliert den Stoffwechsel stark, ist die Hauptquelle der Wärmeerzeugung und seine dynamischen Eigenschaften verleihen ihm eine Schlüsselrolle bei der Atmung, der Bewegung von Körpersegmenten oder der Verschiebung von einem Punkt zum anderen 1,2,3. Die Skelettmuskulatur ist auch für die Pathophysiologie vieler Krankheiten relevant, einschließlich erblicher und chronischer Erkrankungen wie Myopathien, Dystrophien oder Sarkopenie sowie vieler chronischer Erkrankungen außerhalb des Muskels, wie z. B. kardiometabolische Erkrankungen 3,4,5,6,7,8.

Die Ex-vivo-Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften reifer Skelettmuskeln im Kontext von Gesundheit und Krankheit war hauptsächlich durch zwei experimentelle Modelle möglich: ganzer Muskel und isolierte Fasern. Im 20. Jahrhundert nutzten Forscher die Eigenschaften des ganzen, intakten Musculus extensor digitorum longus (EDL), des Soleus, des Tibialis anterior und des Gastrocnemius verschiedener kleiner Spezies als zentrale Modelle, um mehr über motorische Einheiten, Fasertypen und dynamische Eigenschaften wie Kraft und Kinetik von Kontraktion und Entspannung zu erfahren 9,10,11,12,13,14,15,16. Das Aufkommen verfeinerter zellbiologischer Studien verlagerte den Bereich jedoch in Richtung der Untersuchung einzelner Muskelfasern. Pionierarbeit ermöglichte dann die Isolierung von intakten Flexor digitorum brevis (FDB)-Fasern von Ratten durch enzymatische Dissoziation für die anschließende Charakterisierung 17,18,19. Obwohl FDB-Fasern auch durch manuelle Dissektion gewonnen werden können20, haben die Leichtigkeit und der hohe Durchsatz der enzymatischen Dissoziation von murinen Muskeln sowie ihre Eignung für eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen dazu geführt, dass das letztere Modell in den letzten zwei Jahrzehnten weit verbreitet ist.

Die kurzen FDB-Fasern eignen sich für elektrophysiologische und andere biophysikalische Studien, biochemische, metabolische und pharmakologische Analysen, Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie-Experimente, Transfektion für zellbiologische Ansätze oder als Stammzellquelle in Myogenese-Studien 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Die ausschließliche Verwendung von FDB-Fasern in Muskelexperimenten schränkt jedoch den Umfang der Forschung ein, die sich mit Fasertypen befasst, und begrenzt die Menge an biologischem Material, das für einige methodische Techniken oder für die Gewinnung weiterer Informationen von einem Tier zur Verfügung steht. Diese Einschränkungen verhindern eine klare Korrelation zellphysiologischer Phänomene mit früheren biochemischen und dynamischen Studien, die an verschiedenen ganzen, intakten Muskeln (z. B. EDL, SOLEUS, PERONEI) durchgeführt wurden.

Durch die Überwindung dieser Einschränkungen gelang es einigen Gruppen, die längeren EDL- und Soleus-Muskeln 24,33,34,35,36,37,38,39,40 zu dissoziieren, was die Tür öffnete, um die Methode auf andere relevante Muskeln auszudehnen. Die Verwendung von EDL- und Soleus-Fasern ist jedoch immer noch selten, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an methodischen Details, um sie als intakte Fasern zu erhalten. Hier beschreiben wir detailliert, wie man Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln isoliert: drei davon bereits beschrieben (FDB, EDL und Soleus) und drei von ihnen wurden zum ersten Mal erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus [EHL], Peroneus longus [PL] und Peroneus digiti quarti [PDQA]). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass das Modell enzymatisch dissoziierter Fasern für eine Vielzahl von Studien und zukünftige Korrelationen mit bereits veröffentlichten Daten geeignet ist, wodurch die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur erhöht wird.

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Protocol

Alle Verfahren wurden von der Kommission für Ethik bei Tierversuchen der Universität von Antioquia (UdeA) (Protokoll 104 vom 21. Juni 2016 und 005 vom 15. April 2021) gemäß dem Gesetz 84 von 1989 und der Resolution 8430 von 1993 der kolumbianischen Regierung genehmigt und in Übereinstimmung mit den Tierversuchen durchgeführt und gemeldet: Richtlinien für die Berichterstattung über In-vivo-Experimente (ARRIVE)41. Alle hier vorgestellten Ergebnisse stammen von gesunden, 7-13 Wochen alten, 20-26 g schweren, männlichen C57BL/6-Mäusen. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen Aufbau dieser Studie und die Reihenfolge der Verfahren. Alle Reagenzien, Materialien und Ausrüstungsdetails sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiere

  1. Halten Sie maximal sechs Mäuse pro transparentem, rechteckigem Käfig aus Acryl mit Einstreu aus Holz, unter kontrollierten Temperatur- (21 ± 2 °C) und Hell-Dunkel-Zyklen (12:12 h).
  2. Geben Sie den Tieren freien Zugang zu Futter und Leitungswasser in speziellen pathogenfreien Tiereinrichtungen ohne Umweltbereicherung.

2. Sezieren

  1. Lösungen, Materialien und Reagenzien
    1. Die Arbeitslösungen mit folgender Zusammensetzung (alle Konzentrationen in mM) werden vorbereitet und filtriert (0,22 μm):
      1. Tyrod: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 Glukose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissoziation: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Bereiten Sie zwei Sezierkammern vor; Stereoskop; Bedienen einer Schere; feine Schere; feine Pinzetten; und saubere, transparente, nicht konische, 1-1,5 cm breite Glasfläschchen mit 3-4 ml Gesamtvolumen mit Kappen. Richten Sie ein System zur elektrischen Stimulation der Muskeln in den Präparierkammern ein.
    3. Bereiten Sie feuerpolierte Pasteurglaspipetten mit unterschiedlich breiten Spitzen vor: 5, 4, 3, 2 und 1 mm.
    4. Stellen Sie das Wasserbad auf 37 °C ein. Wiegen Sie Aliquote von 3 mg Kollagenase Typ 2.
  2. Verfahren
    1. Opfern Sie die Maus mit Methoden, die von der örtlichen Ethikkommission genehmigt wurden. Eine Zervixluxation wird empfohlen, da sie schnell und weniger stressig ist und die Exposition gegenüber Medikamenten vermeidet, die das Muskelgewebe beeinträchtigen können (wie CO2 oder einige Anästhetika). Beginnen Sie sofort mit der Sektion, um bessere Ergebnisse zu erzielen.
    2. Legen Sie die Maus auf eine Schaumstoffoberfläche und kleben oder stecken Sie die Vordergliedmaßen fest. Schneiden Sie beide Hinterbeine mit der Operationsschere über die Knie, bringen Sie sie jeweils in eine separate Sezierkammer und fügen Sie kalte (10-20 °C) Tyrode hinzu, um das Gewebe zu bedecken.
      HINWEIS: Jede Hintergliedmaße gibt sechs verschiedene Muskeln in der folgenden Reihenfolge: FDB, Soleus, EDL, EHL, PL und PDQA. Detaillierte anatomische Referenzen zur Analyse der sechs von Sehne zu Sehne intakten Muskeln sind in Abbildung 2 und an anderer Stelle42 angegeben.
    3. Stecken Sie die erste Hintergliedmaße in einer Position, in der die hintere Seite der Beine sichtbar ist, an die Präparierkammer. Entfernen Sie die Haut unter Vergrößerung; Legen Sie dann das FDB frei und entfernen Sie es (Abbildung 2). Bewahren Sie es in einer beschrifteten Durchstechflasche mit 1 ml Tyrodelösung auf.
      HINWEIS: Eine angemessene Vergrößerung und vorheriges Training sind erforderlich, um unerwünschte Schnitte im Muskelgewebe zu vermeiden.
    4. Den Soleus freilegen, entfernen und in einer separaten Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode aufbewahren. Verwenden Sie eine feine Schere, um zuerst den Gastrocnemius zu trennen und dann den Soleus zu entfernen, wie in Abbildung 2 gezeigt.
    5. Legen Sie die vordere Seite des Beins frei, entfernen Sie die Haut und identifizieren Sie die distalen Sehnen des Tibialis anterior und die EDL-Muskeln im Knöchel. Entfernen und entsorgen Sie das Tibialis; dann die distalen Sehnen der EDL durchtrennen (Abbildung 2). Setzen Sie die Dissektion fort, bis das EDL entfernt wird, und legen Sie es in ein separates Glasfläschchen mit 1 ml Tyrode.
    6. Entfernen Sie den EHL-Muskel, der direkt hinter und medial der EDL liegt. Beginnen Sie mit der Dissektion, indem Sie die Sehne identifizieren und bis zur 1. Ziffer verfolgen, wie im entsprechenden Feld in Abbildung 2 gezeigt. Bewahren Sie den Muskel in einer separaten Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode auf.
    7. Identifizieren und folgen Sie der äußersten Sehne des Peronei, um sie zu durchtrennen und den PL-Muskel zu entfernen (Abbildung 2). Legen Sie den Muskel in eine separate Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode.
    8. Identifizieren Sie die Sehne und folgen Sie ihr bis zur 4. Stelle; schneiden Sie es und entfernen Sie den PDQA-Muskel (Abbildung 2). Geben Sie es in eine separate Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode.
    9. Wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Hintergliedmaße.
    10. Sammeln Sie beide Muskeln des gleichen Typs in einem beschrifteten Glasfläschchen oder einer kleinen Petrischale mit Tyrodelösung.
      HINWEIS: Wenn während einer Arbeitssitzung mehr als zwei Muskelpaare präpariert werden sollen, rekrutieren Sie zwei Forscher für das Sezierverfahren.

3. Protokoll zur Isolierung von Muskelfasern

  1. Erneuern Sie die Tyrode-Lösung in den Sezierkammern, um Schmutz und Mäusefell zu entfernen. Gießen Sie die FDB-Muskeln in eine Sezierkammer, überprüfen Sie ihre Unversehrtheit und übertragen Sie sie in ein neues Glasfläschchen mit 1 ml Dissoziationslösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den EHL-, PL- und PDQA-Muskeln.
    HINWEIS: Wenn ein Muskel überkontrahiert oder durchtrennt aussieht oder nicht auf die elektrische Stimulation reagiert, fahren Sie nicht mit dem nächsten Protokollschritt fort. Optimieren Sie stattdessen das Sezierprotokoll, indem Sie die Qualität der Lösungen (pH-Wert, Kontamination, Osmolarität) überprüfen und mehr Sezierfähigkeiten erwerben (Abbildung 1C und ergänzendes Video S1).
  2. Führen Sie Längs- oder Diagonalschnitte an den Soleus- und EDL-Muskeln durch, wobei Sie der Ausrichtung der Fasern folgen (Abbildung 2). Folgen Sie für den Soleus der zentralen Sehne und schneiden Sie ~80% seiner Länge ab. Folgen Sie bei EDL einfach einer oder zwei Sehnen und schneiden Sie ungefähr die gleiche Länge wie bei Soleus. Geben Sie jedes Muskelpaar in Glasfläschchen mit 1 ml Dissoziationslösung.
    HINWEIS: Dieses Verfahren verkleinert die EDL und den Soleus und ermöglicht es der Kollagenase, besser in das Gewebe einzudringen. Eine ausreichende Vergrößerung (40-50x) sowie eine feine Schere und Pinzette sind obligatorisch. Überprüfen Sie die Probenintegrität immer durch Sichtprüfung und elektrische Stimulation, bevor Sie mit dem nächsten Schritt des Dissoziationsprotokolls fortfahren.
  3. Geben Sie 3 mg Kollagenase Typ 2 (mit einer Aktivität von 250-300 U/mg) in jede Durchstechflasche mit 1 ml Dissoziationslösung und einem Muskelpaar. Standardisieren Sie die genaue Menge an Kollagenase unter Berücksichtigung der Aktivität der verwendeten Enzymcharge.
  4. Die Muskelpaare im Wasserbad 65-90 min bei 36,8-37 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
    Anmerkungen: Seien Sie streng bei der Temperaturregelung. Standardisieren Sie das Verfahren, damit die Muskeln nicht länger als 100 Minuten in der Kollagenase verbleiben, um Schäden zu vermeiden.
  5. Überprüfen Sie die Fläschchen unter Stereoskopvergrößerung alle 5 Minuten nach der 65. Minute der Inkubation. Wenn die Muskeln leicht gewellt, zerlumpt und locker aussehen, schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig und überprüfen Sie, ob sich einige Fasern leicht lösen. Wenn dies der Fall ist, waschen Sie die Muskeln bei Raumtemperatur mit Tyrode, um die Kollagenase zu inaktivieren und zu entfernen.
    Anmerkungen: Das Waschen muss sorgfältig erfolgen, ohne die Muskeln mit den Pipetten zu berühren. Beginnen Sie mit der Zugabe von 0,8 ml Tyrode und entfernen Sie dann 0,8 ml der Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4-5x und stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig transparent wird.
  6. Trennen Sie mehr Fasern von der Masse der Muskeln mit sehr sanfter Verreibung in Tyrode mit Hilfe des Satzes feuerpolierter Pasteurpipetten. Beginnen Sie damit, die Lösung mit der breitesten Pipette (5 mm Spitze) um den Muskel herum zu rühren und ziehen Sie dann die Muskeln 3-4x vorsichtig in die Pipette hinein und wieder heraus. Wenn der Muskel beginnt, Fasern freizusetzen und dünner wird, wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Pipette (4-mm-Spitze).
    HINWEIS: Fasern, die mit diesem Verfahren gerendert werden, bleiben erregbar und ziehen sich länger als 24 Stunden zügig zusammen, wie z. B. mit PL-, EDL-, EHL- und Soleus-Fasern in Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 und Supplemental Video S5.

4. Experimentelle Verfahren

HINWEIS: Isolierte Fasern wurden für sarkoplasmatische Ca2+ -Konzentrationsschätzungen, morphometrische Messungen und Myosin-Schwerketten-Expressionsstudien (MHC) verwendet.

  1. Messung des sarkoplasmatischen Ca2+ Konzentration während eines Zuckens
    1. Montieren Sie einen sauberen Glasobjektträger auf der experimentellen Badkammer. Beschichten Sie den Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie ihn 30 s trocknen, bevor Sie ~400 μl der Fasersuspension auf den Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 10-15 Minuten bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Montieren Sie die Experimentierkammer auf dem Tisch eines inversen Mikroskops, das für Epifluoreszenz ausgestattet ist (Abbildung 3A).
    3. Evozieren Sie einzelne Zuckungen, um die Lebensfähigkeit der Fasern zu überprüfen, indem Sie rechteckige Stromimpulse (0,8-1,2 ms) durch die beiden Platinelektroden entlang beider Seiten der Experimentierkammer anlegen. Selbst wenn es an Laminin gebunden ist, ist die Kontraktion der Fasern immer noch vor allem an den Extremen sichtbar.
    4. Laden Sie die Fasern mit 3,5-4,5 μM des schnellen Ca2+ Farbstoffs Mag-Fluo-4, AM für 4-5 min in Tyrodelösung. Nach dieser Zeit vorsichtig mit Tyrode waschen, um den extrazellulären Farbstoff zu entfernen. Lassen Sie den intrazellulären Farbstoff unter dunklen Bedingungen ~15-20 min entesterifizieren. Halten Sie die Temperatur immer unter 22 °C, um eine Farbkompartimentierung zu vermeiden.
      HINWEIS: Bereiten Sie einen Vorrat an Mag-Fluo-4, AM nur in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, so dass die Endkonzentration von DMSO in der Beladungslösung weniger als 0,5 % beträgt.
    5. Beleuchten Sie die Faser mit einer weißen Leuchtdiode (LED) und einem Filterset mit den folgenden Wellenlängen für Anregung/dichroit/Emission: 450-490/510/515 nm (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Alternative Anregungsquellen sind Quecksilber- und Xenon-Fluoreszenzlampen. Verwenden Sie die geringstmögliche Intensität und Größe des Anregungsflecks, um ein Photobleichen des Farbstoffs und eine Schädigung der Zelle zu vermeiden.
    6. Rufen Sie die Ca2+ -Reaktion der Faser (sarkoplasmatische Ca2+- Transienten) hervor, indem Sie rechteckige Stromimpulse (0,8-1,2 ms) durch die beiden Platinelektroden anlegen, die auf beiden Seiten der Experimentierkammer bei 20-22 °C platziert sind.
    7. Sammeln und speichern Sie die Lichtsignale mit einem für Fluoreszenz geeigneten 40-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer Photomultiplier-Röhre (PMT), die an einen Digitizer angeschlossen ist (Abbildung 3A und ergänzendes Video S6). Stellen Sie in der Erfassungssoftware eine Skala von 0-200 beliebigen Einheiten (AU) sicher und stellen Sie die Ruhefluoreszenz (F-Rest) des Experiments auf dieser Skala auf 10 AE ein, indem Sie die Größe des Anregungsflecks und die Verstärkung des PMT modulieren. Sobald das Verfahren standardisiert ist, lassen Sie die Verstärkung von einem Experiment zum anderen unverändert und stellen Sie die Skala nur durch geringfügige Anpassungen der Spotgröße ein.
      HINWEIS: Wenn Bewegungsartefakte auftreten, verwenden Sie 20-30 μM N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid (BTS) in der Tyrodenlösung.
    8. Analysieren und kalibrieren Sie die Signale wie folgt:
      1. Tiefpassfilter der gesamten Leiterbahn bei 1 kHz.
      2. Berechnen Sie die F-Pause in 1 s der Leiterbahn, stellen Sie die F-Pause auf 0 ein und messen Sie die Amplitude der Peak-Sarkoplasma-Transienten Ca2+ (F-Peak). Stellen Sie die Amplitude wie in Gleichung (1) dar:
        Equation 1(1)
      3. Berechnen Sie die maximale Ca2+-Konzentration ([Ca2+], μM) unter Verwendung von Gleichung (2)26 und den folgenden Parametern: In-situ-Dissoziationskonstante (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maximale Fluoreszenz (Fmax) von 150,9 AE, minimale Fluoreszenz (Fmin) von 0,14 AE, Mag-Fluo-4-Konzentration [D]T von 229,1 μM26. DerF-Peak wurde bereits in Schritt 4.1.8.2 ermittelt.
        Equation 2(2)
      4. Messen Sie die Anstiegszeit von 10 % bis 90 % der Amplitude (RT, ms), die Dauer bei halbem Maximum (HW, ms) und die Abklingzeit von 90 % bis 10 % der Amplitude (DT, ms). Schätzen Sie dann die Zerfallskinetik gemäß einer Anpassung mit der biexponentiellen Funktion (Gleichung 3):
        Equation 3(3)
      5. Speichern Sie die Werte der Zeitkonstanten des Zerfalls τ1 und τ2 (ms) und der Amplituden A1 und A226.
  2. Morphometrische Messungen
    1. Montieren Sie einen sauberen Glasobjektträger auf der experimentellen Badkammer. Beschichten Sie den Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie ihn 30 s trocknen, bevor Sie ~400 μl der Fasersuspension auf den Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 10-15 Minuten bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Evozieren Sie einzelne Zuckungen, um die Lebensfähigkeit der Fasern zu überprüfen, indem Sie rechteckige Stromimpulse (0,8-1,2 ms) durch die beiden Platinelektroden entlang beider Seiten der Experimentierkammer anlegen. Selbst wenn es an Laminin gebunden ist, ist die Kontraktion der Fasern immer noch vor allem an den Extremen sichtbar.
    3. Nehmen Sie Bilder der lebenden Fasern mit 10x- und 20x-Objektiven und einer Kamera mit mindestens 5 Megapixeln auf, die auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop montiert ist. Speichern Sie die Bilder in . TIFF-Format für Offline-Analysen.
      HINWEIS: Möglicherweise ist ein Satz von ~2-6 Bildern erforderlich, um eine lange Faser vollständig zu erfassen.
    4. Stellen Sie ein Mikroskop-Mikrometer-Kalibrierungslineal unter derselben Vergrößerung vor. Speichern Sie die Bilder in . TIFF-Format für Offline-Analysen.
    5. Messen Sie die Längen und Durchmesser der Fasern mit dem Kalibrierungstool der kostenlosen Software für Bildanalysen wie folgt:
      1. Stellen Sie mit Hilfe des Mikroskop-Mikrometer-Kalibrierungslineals eine Beziehung zwischen Pixeln und dem bekannten Abstand (μm) in den Bildern her, indem Sie das Werkzeug Skalieren analysieren/einstellen verwenden, wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt.
      2. Messen Sie die Längen der Faser einmal von einer Spitze zur anderen und die Durchmesser an 2-6 verschiedenen Stellen entlang der Faser (1-2 Messungen pro Bild, abhängig von ihrer Länge), wie in der ergänzenden Abbildung S1.
      3. Geben Sie den Wert der Länge (μm oder mm) und den Durchschnitt aller pro Faser gemessenen Durchmesser (μm) an.
  3. Studien zur Expression von Myosin-Schwerketten
    HINWEIS: Einzelheiten zur Bestimmung von MHC durch Immunfluoreszenz43 und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)33,44,45,46 in ganzen Muskeln finden Sie in der ergänzenden Datei 1. Das Protokoll für die Fasertypisierung durch Immunfluoreszenzbestimmung von MHC in der Suspension von FDB-isolierten Fasern lautet wie folgt:
    1. Beschichten Sie jeden der fünf sauberen Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie es 30 s trocknen, bevor Sie ~300 μl der Fasersuspension auf jeden Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 4 h bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Fixieren Sie die Zubereitungen mit gefriergekühltem Aceton für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. 3x schonend mit PBS waschen.
    4. Permeabilisieren Sie die Zellmembranen mit PBS, ergänzt mit 0,7% Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur.
    5. 3x vorsichtig mit PBS waschen, ergänzt mit 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,04 % Triton X-100, und anschließend mit PBS mit 2 % BSA, 2 % Ziegenserum und 0,4 % Triton X-100 30 min bei Raumtemperatur blockieren.
    6. 3x vorsichtig mit PBS mit 0,2 % BSA und 0,04 % Triton X-100 waschen und mit den primären Antikörpern wie folgt inkubieren:
      1. Verdünnen Sie jeden Anti-MHC-Primärantikörper in einer separaten Durchstechflasche in PBS mit 1 % BSA und 0,04 % Triton X-100: Anti-I (1:1.500), Anti-II (1:600), Anti-IIA (verwenden Sie das gesamte konditionierte Medium aus dem Hybridom) und Anti-IIB (1:500).
      2. Inkubieren Sie jeden Objektträger mit einem Antikörper und den restlichen Objektträger mit PBS als Kontrolle für 12-16 h bei 4 °C.
        HINWEIS: In diesem Protokoll blieben Fasern des Typs IIX in allen Proben unmarkiert.
    7. Waschen Sie vorsichtig 3x mit PBS und inkubieren Sie alle Objektträger mit dem sekundären Antikörper (1:800), der an ein fluoreszierendes grünes Molekül gekoppelt ist, für 1-2 h bei Raumtemperatur.
    8. Färbekern mit 1 μg/mL Hoechst für 15 min.
    9. 3x vorsichtig mit PBS waschen, vorsichtig 20-40 μl Eindeckmedium hinzufügen und ein Deckglas anbringen.
      HINWEIS: Sanfter Lösungswechsel und Waschen stellen sicher, dass Dutzende von Fasern am Objektträger haften, wodurch das Experiment statistisch fundiert ist.
    10. Visualisieren Sie jeden Objektträger mit einem 10x-Objektiv, das für Fluoreszenz geeignet ist, und einem Filtersatz mit den folgenden Wellenlängen für Anregung/dichroit/Emission: 450-490/510/515 nm und zählen Sie alle positiven und negativen Fasern. Alternativ können Sie Fluoreszenzbilder unter den gleichen technischen Bedingungen und mit einer Kamera von mindestens 5 Megapixeln aufnehmen, die auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop montiert ist, und speichern Sie sie in . TIFF-Format für Offline-Analysen.
    11. Zeichnen Sie die positiven und negativen Fasern jedes Objektträgers in einer Datenbank auf und berechnen Sie die Prozentsätze der positiven I-, IIA-, IIB- und Gesamt-II-Fasern basierend auf der Gesamtzahl der im entsprechenden Objektträger vorhandenen Fasern. Berechnen Sie den Prozentsatz der IIX-Fasern, indem Sie die Summe von IIA+IIB vom Prozentsatz der gesamten II-Fasern subtrahieren. Schätzen Sie den Prozentsatz der Hybrid-I/IIA-Fasern, indem Sie die Summe von I+II von einem Wert von 100% subtrahieren. Ziehen Sie schließlich den Prozentsatz der Hybridzellen von der Summe von I und II ab, um die reinen Fasern vom Typ I und II zu erhalten.
      HINWEIS: In MHC-Zusammensetzungsstudien werden Fasertypen mit einem Großbuchstaben bezeichnet, während Isoformen mit einem Kleinbuchstaben46 gekennzeichnet sind.
  4. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
    1. Beschichten Sie einen sauberen Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie ihn 30 s trocknen, bevor Sie ~300 μl der Fasersuspension auf den Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 4 h bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Fixieren Sie das Präparat mit Carnoy-Lösung (60% absolutes Ethanol, 30% Chloroform, 10% Essigsäure) für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. 90 s mit Hämatoxylin inkubieren.
    4. 3x vorsichtig mit Leitungswasser waschen.
    5. Mit 1 % Eosin Y, hergestellt in 70 % Ethanol, 30 s lang inkubieren.
    6. 3x vorsichtig mit Leitungswasser waschen.
    7. Tauchen Sie 3x in absolutes Ethanol.
    8. 60 s in Xylol inkubieren.
    9. Fügen Sie 20-40 μl Eindeckmedium hinzu und visualisieren Sie es mit einem herkömmlichen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder mit der gewünschten Vergrößerung mit einer Farbkamera von mindestens 5 Megapixeln auf.

5. Statistische Analysen und grafische Darstellung

HINWEIS: Die Versuchseinheit ist eine Muskelfaser.

  1. Geben Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung aus und berechnen Sie Konfidenzintervalle von 95 % (KI 95 %) für einige Analysen.
  2. Um die Kinetik von Länge, Durchmesser und Ca2+ -Transienten zwischen Gruppen zu vergleichen, führen Sie eine Varianzanalyse (ANOVA) und Post-hoc-Tests mit der Korrektur von Bonferroni durch.
  3. Bewerten Sie die Normal- und Varianzgleichheit mit den Shapiro-Wilk- bzw. Levene-Tests.
  4. Betrachten Sie die Unterschiede als signifikant, wenn p 0,05 <.

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Representative Results

Sarkoplasmatische Ca2+ -Konzentration während eines Zuckens
Um die Durchführbarkeit physiologischer Experimente in der Menge dissoziierter Fasern zu demonstrieren und unsere bisherigen Erkenntnisse über die Erregungs-Kontraktions-Kopplung (ECC) und die Fasertypen zu erweitern, wurden Ca2+-Transienten in Fasern aller Muskeln erfasst. Erstens zeigten FDB (n = 5) und EDL (n = 7) eineCa-2+-Kinetik, die als Morphologietyp II (MT-II) bekannt ist. Dies sind schnelle, stachelige Signale, deren RT ~1 ms dauert; seine Zerfallsphase kann mit einer biexponentiellen Funktion ausgestattet werden, wobei die erste Komponente (A1) größer als 30 % der gesamten Amplitude ist, und seine Spitze [Ca2+] liegt zwischen 15 und 30 μM33,47 (Abbildung 3B). Ihre Ergebnisse sind in der ersten Spalte von Tabelle 1 zusammengefasst (n = 12), während die Ergebnisse der Ca2+-Transienten des Soleus (n = 6) in der zweiten Spalte von Tabelle 1 dargestellt sind. Die Signale des Soleus wurden als Morphologie Typ I (MT-I, Abbildung 3B) klassifiziert - breiter, mit einer RT über 1,2 ms, einem A1 von weniger als 30% und einem Peak [Ca2+] zwischen 7 und 13 μM33,47. Diese beiden Spalten wurden als Referenzen für den Vergleich der Ca2+ Transienten der neuen Muskeln angesehen. Da sich alle Fasern von PDQA (n = 4), PL (n = 6) und EHL (n = 4) die MT-II teilten (Abbildung 3B), sind ihre Daten in der dritten Spalte von Tabelle 1 zusammengefasst (n = 14). Diese Signale zeigten eine durchschnittliche RT von ~1 ms, ein A1 von ~45%, einen Peak [Ca2+] über 15 μM und lassen sich sehr gut mit den in der ersten Spalte dargestellten Ergebnissen vergleichen, unterscheiden sich jedoch deutlich von denen in der zweiten Spalte, wie die statistische Analyse (Tabelle 1) bestätigt. Das schnellste Signal der gesamten Probe kam von einer EHL-Faser mit einem ΔF/F von 0,66, [Ca2+] von 16,99 μM, RT von 0,85 ms, HW von 2,42 ms und DT von 10,56 ms.τ 1 undτ 2 betrugen 1,63 bzw. 7,21 ms, während die Werte von A1 undA 2 56,60 % bzw. 43,40 % betrugen. Das langsamste Signal kam von einer Soleus-Faser mit einem ΔF/F von 0,41, [Ca2+] von 9,76 μM, RT von 1,56 ms, HW von 9,43 ms und DT von 31,88 ms.τ 1 undτ 2 betrugen 2,81 bzw. 96,42 ms, während die Werte von A1 undA 2 19,55 % bzw. 80,45 % betrugen. 

Eine Batterie aus kurzen, mittleren und langen Fasern
Die Beobachtung deutlicher Unterschiede zwischen den Fasern nach ihrer Muskelquelle ermöglichte eine vollständigere morphometrische Charakterisierung. Die Histogramme von Abbildung 4 zeigen auffällige Unterschiede in den Längen der Fasern über alle Muskeln hinweg. Dies wird deutlich, wenn man die kürzeste Faser von FDB (227,06 μm) mit der längsten von Soleus (5,69 mm) vergleicht. Die mittleren Längenwerte sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Es gab signifikante statistische Unterschiede zwischen den Gruppen (p < 0,01). Diese Ergebnisse ermöglichen die Klassifizierung von FDB-Fasern als kurz (<1 mm); PDQA und PL als Zwischenprodukt (1 bis 3 mm); und EDL, EHL und Soleus so lang (>3 mm) (Ergänzende Abbildung S2).

Umgekehrt wurden geringfügige Unterschiede bei den durchschnittlichen Durchmessern der Fasern aller Muskeln (Tabelle 2) und der Verteilung der Werte (Abbildung 4) beobachtet. Dennoch gab es signifikante statistische Unterschiede zwischen den Gruppen (p < 0,01). Bei der detaillierten Auswertung zeigten sich Unterschiede zwischen FDB und untereinander sowie zwischen FDB (FDB 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) und dem Pool an intermediären und langen Fasern (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). Die dünnste Zelle der gesamten Probe maß 18,42 μm (FDB) und die dickste erreichte 82,79 μm (PDQA).

Fasertypen, die in physiologischen Experimenten verwendet werden
Zunächst wurden die in jedem gesamten Muskel vorhandenen Fasertypen durch Immunfluoreszenz bestimmt. Mit Ausnahme des Soleus zeigten die Muskeln eine Dominanz von über 76 % der Typ-II-Fasern (Ergänzende Abbildung S3, Tabelle 3 und Tabelle 4). EHL, PL und PDQA sind besonders schnelle Muskeln, mit über 90 % schnellen Fasern und bis zu 58,8 % Typ-IIB-Fasern, wie sie in PDQA vorkommen. EHL und PDQA waren praktisch frei von Typ-I-Fasern. Hybride I/IIA-Fasern waren in allen Muskeln in geringen Prozentsätzen vorhanden. Wie erwartet machten Typ-I- und IIA-Fasern über 82 % der gesamten Fasern des Soleus aus. Dieser Muskel ist fast frei von den schnellsten IIB-Fasern. Nach dem Profil der Fasertypen ist der Soleus der langsamste und der PDQA der schnellste Muskel der sechs analysierten.

Danach, und weil es für physiologische Einzelfaserexperimente relevanter ist, wurde die Frage beantwortet, welche Arten von Fasern in der Zellsuspension erscheinen, die aus dem dissoziierten FDB gewonnen wurde. Es zeigte sich, dass das Profil der Fasern in der Zellsuspension die Zusammensetzung der in den Kryoschnitten vorhandenen Fasern widerspiegelt: Drei von vier dissoziierten Fasern waren Typ II (Abbildung 5 und Tabelle 3).

Schließlich wurde die Zusammensetzung der Muskeln durch Trennung ihrer MHC-Isoformen durch SDS-PAGE bestätigt. Die Ergebnisse stimmten mit dem allgemeinen Muster überein, das in den Immunfluoreszenz-Assays beobachtet wurde. Der Soleus war mit MHC IIa und I angereichert, während EDL, EHL und Peronei mit MHC IIx und IIb angereichert waren, aber frei von I waren (Ergänzende Abbildung S4).

Figure 1
Abbildung 1: Design der Studie. (A) Geräte und Lösungen, die vor Beginn des Sezierverfahrens einzurichten sind. 1. Stereoskop Nummer eins. 2. Von unten nach oben: ein Set aus fünf feuerpolierten Pipetten, Sezierwerkzeugen und Kollagenase-Fläschchen in einem tragbaren Kühler (gelbes Gehäuse). 3. Filtergehäuse, Sezierkammer, beschriftete Glasfläschchen mit Kappe, Gestell mit gefilterten Lösungen. 4. Sezierwerkzeuge. 5. Stereoskop mit Sezierkammer Nummer zwei, gekoppelt mit einer Kamera und einem elektrischen Stimulator. (B) Das Sezierverfahren des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen, wie in Abbildung 2 näher erläutert. (C) Nach der Dissektion müssen die Muskelkontraktion und -integrität überprüft werden, bevor mit dem nächsten Protokollschritt fortgefahren wird. Der linke Muskel im linken Bereich zeigt einen welligen, hyperkontrahierten, nicht reagierenden PL-Muskel (blauer Pfeil), der nicht zur Gewinnung dissoziierter Fasern verwendet werden darf. Stattdessen muss das Präparierprotokoll optimiert und neu gestartet werden. Das gut präparierte PL-Gegenstück (rechter Muskel im linken Bereich) zeigt ein längliches Erscheinungsbild und zieht sich sichtbar zusammen (Ergänzungsvideo S1). Das Panel auf der rechten Seite zeigt zwei EDL- (blauer Pfeil) und zwei FDB-Muskeln innerhalb der Kollagenaselösung mit dem korrekten, geraden Aussehen. (D) Sobald die Muskeln dissoziiert sind, gießen Sie die isolierten Fasern in die Versuchskammer und überprüfen Sie ihre Kontraktion und Unversehrtheit. Im linken Bereich aktive (blauer Pfeil) und tote PL-Fasern. Auf der rechten Seite aktive (blauer Pfeil) und tote EDL-Fasern. (E-G) Mit den isolierten Fasern wurden drei Versuchsreihen durchgeführt: (E) Sarkoplasmatische Ca2+-Konzentrationsmessungen während eines Zuckens (Ergebnisse in Abbildung 3). (F) Morphometrische Analysen (Ergebnisse in Abbildung 4). Dieses Beispiel zeigt eine PL-Faser. (G) Immunfluoreszenz für Myosin-Schwerkettenexpressionsstudien (Ergebnisse in Abbildung 5 dargestellt). Dieses Beispiel zeigt eine isolierte FDB-Faser. Maßstabsleisten = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Anatomische Referenzen und allgemeines Verfahren zum Sezieren des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln einer Maus. Reihen, von oben nach unten, präsentieren die Muskeln in der besten Reihenfolge der Sektion: FDB, Soleus, EDL, EHL, PL und PDQA. Spalten von links nach rechts stellen die Meilensteine während der Sektion dar. Die erste Spalte zeigt die freiliegenden Muskeln oder ihre distalen Sehnen, damit die Dissektion beginnen kann. Blaue Pfeile zeigen zum Beispiel auf die FDB und den Soleus in situ und auf die distalen Sehnen der EDL. Die folgenden beiden Spalten veranschaulichen die Dissektion selbst und die nach dem Durchtrennen der distalen Sehne(n) freigelegten Muskeln, wie z.B. mit dem blauen Pfeil in der EDL-Zeile gekennzeichnet. Es wird empfohlen, den auf die fünfte Stelle gerichteten Zweig der FDB zu entfernen. Die Spalte ganz rechts zeigt die Muskeln, sobald sie vollständig entfernt wurden, wobei die proximalen Sehnen zum oberen Teil der Bilder ausgerichtet sind. Blaue, diskontinuierliche Linien (äußerste rechte Spalte) veranschaulichen die Längs- oder Diagonalschnitte, die in den Soleus- und EDL-Muskeln durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass die Kollagenase in ihre Masse gelangt. Maßstabsleisten = 5 mm. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = Extensor hallucis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ca2+ Transienten, aufgezeichnet in Fasern, die aus einem Satz von sechs Hintergliedmaßenmuskeln einer Maus gewonnen wurden. (A) Aufbau zur Erfassung von Ca2+ Transienten bei gedimmter Beleuchtung. Linkes Bild: 1. PMT angeschlossen an ein inverses Fluoreszenzmikroskop (2). 3. Kamera mit dem Mikroskop gekoppelt. 4. Elektrischer Stimulator, der an die Versuchskammer gekoppelt ist. 5. Das Mikromanipulationssystem kann verwendet werden, wenn Elektrophysiologie- und Injektionsassays geplant sind, um die Erfassung von Ca2+ -Transienten zu ergänzen. Mittlere Platte: Die Experimentierkammer (Einsatz) mit den beladenen Zellen wird auf den Tisch des Mikroskops montiert und mit blauem Licht (450-490 nm, blauer Pfeil) beleuchtet, um den Farbstoff anzuregen. In diesem Aufbau werden die Elemente 1 bis 5 über einem Antivibrationstisch und in einem Faradayschen Käfig platziert. Rechtes Panel: Sobald die Qualität der Kontraktion und der Farbbeladung mit der Kamera (6) überprüft wurde, wird das emittierte Licht auf das PMT gerichtet, die elektrische Stimulation beginnt und das Signal wird dem Digitizer (7) und der Erfassungssoftware (8) zugeführt, um die Ca2+ -Transiente aufzuzeichnen. Die integrierte Funktion dieser Elemente während eines Live-Experiments ist im Ergänzungsvideo S6 zu sehen. (B) Repräsentative, kalibrierte Ca2+ -Transienten von FDB-, PDQA-, PL-, EDL-, EHL- und Soleus-Fasern von Mäusen. Die ähnlichen, schnellen, schmalen Signale von FDB, PDQA, PL, EDL und EHL bestätigen, dass MT-II bereits von IIX- und IIB-Fasern abstammt, die in diesen Muskeln am häufigsten vorkommen. Im Gegensatz dazu ist der Soleus transient langsamer und kleiner, typisch für MT-I, das ursprünglich in I- und IIA-Fasern beschrieben wurde. Die rote Kurve über den EDL- und Soleus-Signalen zeigt, dass die Zerfallsphase von MT-I und MT-II mit einer biexponentiellen Zerfallsfunktion ausgestattet werden kann. Kalibrierbalken gelten für alle Panels. Vertikaler Balken = 2,5 μM von [Ca2+], horizontaler Balken = 10 ms. Der Farbschlüssel am unteren Rand hilft bei der Identifizierung der Muskeln. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = Extensor hallucis longus; PMT = Photomultiplier-Röhre; MT-I = Morphologie Typ I; MT-II = Morphologie Typ II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Morphometrische Messungen der kurzen, mittleren und langen Fasern, die durch enzymatische Dissoziation des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln einer Maus erhalten wurden. Intakte, gesunde, repräsentative Fasern aus jedem Muskel sind in den Spaltenfeldern ganz links dargestellt. Die Bilder wurden nur bearbeitet, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren und den Kontrast zu verbessern, ohne die Muskelfasern direkt zu manipulieren. Maßstabsleisten = 100 μm (alle Panels). Das Messprotokoll sowie das Aussehen und die Qualität der gesamten langen Fasern können in der ergänzenden Abbildung S1 weiter angesehen werden. Die mittlere Spalte zeigt die Längenverteilungen, geordnet vom Muskel, der die kürzesten Fasern (FDB) gebildet hat, bis zum Muskel mit den längsten Fasern (Soleus). Es gibt ein Kontinuum von Längen, so dass es eine gewisse Überlappung zwischen den Muskeln gibt, die sich über insgesamt ~5,5 mm erstreckt. Durchmesserverteilungen werden in den Spaltenfeldern ganz rechts dargestellt. Die meisten Fasern liegen zwischen 30 und 60 μm, mit kleinen Unterschieden zwischen den Muskeln. Test-Retest-Analysen (n = 78 Fasern, entspricht 9,85 % der gesamten Stichprobe von n = 792) der morphometrischen Messungen zeigten eine sehr hohe Reproduzierbarkeit (mittlerer Variationskoeffizient von 1,77 % ─ Konfidenzintervall 95 %, CI 95 %, 1,26-2,27 % ─ mittlerer Korrelationskoeffizient von 0,99 (CI 95 % 0,98-0,99)), was die gute Zuverlässigkeit der Ergebnisse unterstreicht. Gaußsche Verteilungskurven wurden mit lizenzierter Grafiksoftware hinzugefügt. Ergänzende Abbildung S2 zeigt Balkendiagramme der Mittelwerte von Länge und Durchmesser und die Zusammenführung der Längen- und Durchmesserverteilungen aller Muskeln zum leichteren Vergleich. Der Farbschlüssel am unteren Rand hilft bei der Identifizierung der Muskeln. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL, = extensor hallucis longus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Immunfluoreszenz-Assays für Fasertypen in der Zellsuspension in dissoziierten FDB-Muskeln. Bilder von verschiedenen Feldern zeigen intakte, dissoziierte FDB-Fasern, die an der Unterseite der Objektträger haften. (A) Eine Antimyosin-II-positive Faser (grüne Fluoreszenz, diagonaler hellblauer Pfeil) kontrastiert deutlich von einer negativen (hellblaue Pfeilspitze), was die Unterscheidungskraft des Assays demonstriert. Das Vorhandensein beider Fasern im Bild kann durch die Markierung der Kerne (blaue Fluoreszenz) bestätigt werden. (B) Ein anderes Feld zeigt eine andere Antimyosin-II-positive Faser. (C) Die korrekte Identifizierung der Myosin-Schwerkette in den A-Banden (grüne Fluoreszenz) durch die Antikörper wurde durch konfokale Mikroskopie bestätigt. Die berüchtigtsten transversalen schwarzen Streifen entsprechen den mit Aktin angereicherten I-Banden und werden daher von den Antikörpern voraussichtlich nicht erkannt. (D) Hämatoxylin markiert violett die typischen peripheren, reichlich vorhandenen Kerne, und Eosin markiert das Sarkoplasma der Faser und zeigt eine intakte, reife Zelle. Maßstabsleisten = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Abkürzung: FDB = Flexor digitorum brevis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Fasern FDB und EDL Schollenmuskel PDQA, PL und EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0,68±0,15 0,46±0,06*,† 0,66±0,12 <0,01
[CA2+] (μM) 17.46±5.18 Uhr 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0,01
RT (ms) 0,95±0,10 1,26±0,20*,† 0,95±0,09 <0,01
Steigung (F/ms) 5,97±1,41 3.12±0.79*,† 5,83±0,97 <0,01
HW (ms) 3,59±0,85 8.17±3.00*,† 3,19±0,54 <0,01
BMK (ms) 16,98±7,37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0,01
Decay-Flankensteilheit (F/ms) -0,24±0,07 -0,10±0,03*,† -0,35±0,08* <0,01
τ1 (ms) 1,86±0,37 2,07±0,66† 1,57±0,18 <0,05 kg
τ2 (ms) 11.50±3.93 Uhr 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0,01
A1 (%) 48.14±7.27 25,94±8,98*,† 44,59±8,29 kg <0,01
A2 (%) 51,86±7,27 kg 74.06±8.98*,† 55,41±8,29 <0,01
Morphologie MT-II MT-I MT-II

Tabelle 1: Kinetik von Ca2+ Transienten in enzymatisch dissoziierten Fasern, die aus einem Satz von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. p-Werte entsprechen dem Varianzanalysetest. *Deutlich anders als die FDB- und EDL-Gruppen. †Deutlich anders als die PDQA-, PL- und EHL-Gruppen. Abkürzungen: F = Fluoreszenz; [Ca2+] = zytosolische Peak-Ca2+ -Konzentration; RT = Anstiegszeit; HW = Dauer bei halbem Maximum; DT = Abklingzeit; τ1 und τ2 = Zeitkonstanten des Zerfalls; A1 und A2 = Amplituden des Zerfalls; FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = Extensor hallucis longus; MT-I = Morphologie Typ I; MT-II = Morphologie Typ II.

Fasern FDB PDQA PL EDL EHL Schollenmuskel p
n 370 142 80 70 87 43
Länge (mm) 0,42±0,05* 2,20±0,26** 2,69±0,26† 3,51±0,53†† 3,83±0,44‡ 4,62±0,64 <0,01
Durchmesser (μm) 38.40±9.40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44,43±7,62 kg 41,96±9,16 kg 46,36±12,85 <0,01

Tabelle 2: Morphometrische Messungen der kurzen, mittleren und langen Fasern, die durch enzymatische Dissoziation des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln der Maus erhalten wurden. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. p-Werte entsprechen dem Varianzanalysetest. *Statistisch anders als PDQA, PL, EDL, EHL und Soleus. **Deutlich anders als PL, EDL, EHL und soleus. †Deutlich anders als EDL, EHL und Soleus. ††Deutlich anders als EHL und Soleus. ‡Deutlich anders als Soleus. Deutlich anders als EHL. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Muskeln/Fasern N n Typ I + I/IIA insgesamt (%) Typ II insgesamt (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 Uhr 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76,54±2,51 kg

Tabelle 3: Fasertypen in Kryoschnitten und in der Zellsuspension in dissoziierten FDB-Muskeln von Mäusen. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. N bezieht sich auf die Anzahl der Tiere, während n sich auf die Gesamtzahl der in den Experimenten analysierten Fasern bezieht. Die FDB-Reihe zeigt Daten des gesamten Muskels, wie sie in Kryoschnitten bestimmt wurden, während die *FDB-Reihe isolierten Fasern in der Zellsuspension nach der Dissoziation des Muskels entspricht. Die Spalte "Gesamttyp II" spiegelt die reinen Fasern vom Typ IIA, IIX und IIB wider. Abkürzung: FDB = Flexor digitorum brevis.

Muskel N n Typ I (%) Typ I/IIA (%) Typ IIA (%) Typ IIX (%) Typ IIB (%) Typ II insgesamt (%)
PDQA 4 597 0,00±0,00 10.15±2.62 Uhr 19.33±6.19 Uhr 11.68±7.57 58,84±7,63 kg 89,85±2,62
PL 4 576 3,44±3,94 2.04±2.48 23.01±7.03 35,85±5,66 kg 35.66±9.36 94,52±3,90 kg
EDL 4 826 0,00±0,00 10.44±8.33 Uhr 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89,56±8,33 kg
EHL 5 618 0,24±0,76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94,47±3,05 kg
Schollenmuskel 4 729 32.18±4.48 1,74±1,30 50,37±7,46 kg 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59 kg

Tabelle 4: Fasertypen in Kryoschnitten der Muskeln, die mittlere und lange Fasern der Maus ergeben. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. N bezieht sich auf die Anzahl der Tiere, während n sich auf die Gesamtzahl der in den Experimenten analysierten Fasern bezieht. Alle Reihen zeigen Daten des gesamten Muskels, wie sie in Kryoschnitten bestimmt wurden. Säulen vom Typ I, IIA, IIX und IIB spiegeln reine Fasern wider, während sich die I/IIA-Säule auf Hybridfasern bezieht. Die Spalte "Typ II insgesamt" ist die Summe der Spalten vom Typ IIA, IIX und IIB. Abkürzungen: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Ergänzende Datei 1: Studien zur Expression von Myosin-Schwerketten in ganzen Muskeln. Die Protokolle enthalten Details zur Bestimmung von Myosin-Schwerketten-Isoformen durch Immunfluoreszenz in Kryoschnitten und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Homogenaten der gesamten Muskeln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Details der Morphologie der Fasern, die durch enzymatische Dissoziation des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln der Maus erhalten wurden. (A) Das Mikroskopmikrometer-Kalibrierungslineal, das zum Einstellen der Skala in der Bildanalysesoftware geöffnet ist, ist links dargestellt. Das rechte Feld zeigt, wie der Durchmesser wiederholt gemessen wurde, wie durch die blauen Linien senkrecht zur Längsachse der Faser (blaue Pfeile) angezeigt, während die Länge einmal von Spitze zu Spitze gemessen wurde, wie durch die blaue Linie entlang der Hauptachse der Faser dargestellt. (B) Mehrere Bilder wurden mit geringfügigen Bearbeitungen zusammengestellt, um das lange und gesunde Aussehen von PDQA-, PL-, EDL-, EHL- und Soleus-Fasern (kleine blaue, grüne, gelbe, orangefarbene und rosa Einsätze) zu demonstrieren. Die zusammengesetzten Bilder wurden weiter bearbeitet, um den Fasern ein besseres Aussehen zu verleihen (große, schwarz-weiße Bilder). (C) DIC-Bilder von FDB-, PDQA-, PL- und Soleus-Fasern, die die normale Unregelmäßigkeit ihrer Spitze und ihre bekannten transversalen Streifen hervorheben. Das DIC-Erscheinungsbild der verbleibenden EDL- und EHL-Fasern ist im Ergänzungsvideo S3 und im Ergänzungsvideo S4 zu sehen. Maßstabsleisten = 100 μm. Der Farbschlüssel am unteren Rand hilft bei der Identifizierung der Muskeln. Abkürzungen: FDB, Flexor digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, Extensor digitorum longus; EHL, Extensor hallucis longus; DIC = Differentieller Interferenzkontrast. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Balkendiagramme und zusammengeführte Längen- und Durchmesserverteilungen der Fasern, die durch enzymatische Dissoziation des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln einer Maus erhalten wurden. (A) Balkendiagramme (Mittelwert ± Standardabweichungen) und (B) zusammengeführte Histogramme bestätigen die Diskrepanz der Längen, aber die Ähnlichkeit der Durchmesser über alle Gruppen hinweg. *Deutlich anders als PDQA, PL, EDL, EHL und Soleus. **Deutlich anders als PL, EDL, EHL und soleus. †Deutlich anders als EDL, EHL und Soleus. ††Deutlich anders als EHL und Soleus. ‡Deutlich anders als Soleus. Deutlich anders als EHL. Der Farbschlüssel am unteren Rand hilft bei der Identifizierung der Muskeln. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Immunfluoreszenzstudien zur Fasertypzusammensetzung des Satzes von sechs Hintergliedmaßenmuskeln einer Maus. Repräsentative Antikörper-markierte Kryoschnitte, die für die Analysen verwendet werden, zeigen die gute Qualität und Unversehrtheit der Proben. Es gibt eine klare Dominanz des Fasertyps II in allen Muskeln, mit Ausnahme des Soleus, in dem die Menge des Fasertyps I beträchtlich ist. Maßstabsleisten = 100 μm. Der Farbschlüssel am unteren Rand hilft bei der Identifizierung der Muskeln. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Elektrophoretische Trennung von MHC-Isoformen im Satz von sechs Hintergliedmaßenmuskeln einer Maus. (A) Zwei repräsentative vollständige Gele, die an verschiedenen Tagen mit unterschiedlichen Proben betrieben werden, zeigen die Qualität, Sauberkeit und Reproduzierbarkeit des Trenn- und Migrationsabstands der MHC-Isoformen, wenn sie mit Coomassie-Blau gefärbt werden. Obwohl diese beiden Bilder leicht bearbeitet wurden, um den Kontrast und die Klarheit für den Leser zu verbessern, wurden die Analysen in unbearbeiteten Gelen durchgeführt. (B) Beispiele für die Analyse der Bänder für jeden der sechs Muskeln. Nachdem ein ROI in den Lanes des Gels ausgewählt wurde, wird ein Diagrammprofil generiert und eine Gaußsche Anpassung verwendet, um den Anteil der MHC-Isoformen in der Gruppe von sechs Muskeln zu schätzen. Die gefundene MHC-Zusammensetzung war: FDB: I 9,0 ± 5,0 %, IIa + IIx 91,0 ± 5,0 % (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4 %, IIb 74,1 ± 2,4 % (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2 %, IIb 75,1 ± 2,2 % (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3 %, IIb 78,0 ± 2,3 % (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0 %, IIb 72,5 ± 1,0 % (n = 3); soleus: I 35,8 ± 2,5 %, IIa (+IIx + IIb, falls vorhanden) 64,2 ± 2,5 % (n = 4). Der Farbschlüssel am unteren Rand hilft bei der Identifizierung der Muskeln. Das graue Rechteck unter dem Gel ganz rechts in A bezieht sich auf den Molekulargewichtsmarker, der die Migration des IIa zu ~ 200 KDa anzeigt. Abkürzungen: FDB = Flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = Extensor digitorum longus; EHL = Extensor hallucis longus; MHC = Myosin-Schwerkette; ROI = Region von Interesse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video S1: Der beschädigte, gewellte Peroneus longus (PL, links) zieht sich bei Stimulation nicht zusammen, während sich der intakte PL (rechts) gut zusammenzieht, selbst wenn er weiter von den Elektroden entfernt ist. 0,8-fache Vergrößerung. Das Stimulationsprotokoll gibt rechteckige Stromimpulse von 1,2 ms, 0,7 Hz und 50 V über zwei Elektroden frei. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: Kontraktion der Peroneus longus-Faser. 20-fache Vergrößerung. Differentieller Interferenzkontrastmodus. Das Stimulationsprotokoll gibt rechteckige Stromimpulse von 1,2 ms, 0,5 Hz und 50 V über zwei Platinelektroden frei. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S3: Kontrahierende Faser des Extensor digitorum longus. 20-fache Vergrößerung. Differentieller Interferenzkontrastmodus. Das Stimulationsprotokoll gibt rechteckige Stromimpulse von 1,2 ms, 0,5 Hz und 50 V über zwei Platinelektroden frei. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S4: Kontrahierende Streckung der Hallucis longus-Faser. 20-fache Vergrößerung. Differentieller Interferenzkontrastmodus. Das Stimulationsprotokoll gibt rechteckige Stromimpulse von 1,2 ms, 0,5 Hz und 50 V über zwei Platinelektroden frei. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S5. Soleus-Faser kontrahieren. 20-fache Vergrößerung. Differentieller Interferenzkontrastmodus. Das Stimulationsprotokoll gibt rechteckige Stromimpulse von 1,2 ms, 0,5 Hz und 50 V über zwei Platinelektroden frei. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S6: Live-Aufnahme eines Ca2+- Transienten von einer mit Mag-Fluo-4, AM beladenen Extensor-digitorum-longus-Faser, wie in Schritt 4.1.4 beschrieben. Das Stimulationsprotokoll gibt rechteckige Stromimpulse von 1,2 ms, 0,5 Hz und 50 V über zwei Platinelektroden frei. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Als Ergänzung zu den Modellen, die für die Untersuchung der Biologie der reifen Skelettmuskulatur zur Verfügung stehen, zeigen wir hier die erfolgreiche enzymatische Dissoziation einer Reihe von Mausmuskeln mit kurzen, mittleren und langen Fasern. Diese Fasern ermöglichen den Nachweis der Generalisierbarkeit der MT-II-Kinetik der Ca2+ -Transienten im Skelettmuskel. Weiterhin wurden die Fasertypen in den intakten, ganzen Muskeln klassifiziert. Da der FDB der am häufigsten verwendete Muskel für physiologische Experimente ist, wurden die Arten von Fasern bewertet, die nach der Dissoziation in der Zellsuspension vorhanden sind.

Eine Batterie kurzer, mittlerer und langer intakter Fasern für muskelbiologische Studien
Die Dissektionstechnik, die Dauer der enzymatischen Behandlung, die Art des verwendeten Enzyms und das Verreibungsverfahren sind kritische Schritte innerhalb des Protokolls, um intakte enzymatisch dissoziierte Fasern zu erhalten. Die Dissektion muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, um die Zeit unter Hypoxie zu verkürzen und unnötige Dehnungen zu vermeiden. Letzteres ist besonders relevant für den Soleus, der nicht durch Hochziehen des Gastrocnemius-Soleus-Komplexes entfernt werden darf. Darüber hinaus schädigen eine umfangreiche enzymatische Behandlung (~3 h)20,48 und schlechte Verreibungsverfahren (z.B. harte, geringe Erfahrung des Forschers) die Zellen, wie in mehreren Laboratorien empirisch bestätigt wurde. Kollagenase Typ 2 wird gegenüber anderen Kollagenasetypen empfohlen. Die Bildung von Blasen während der Verreibung muss vermieden werden und entweder die Muskeln oder die Fasern dürfen nur mit Glaspipetten anstelle von Kunststoffpipettenspitzen manipuliert werden. Die Verwendung von Glasfläschchen wird während des gesamten Eingriffs gegenüber konischen Kunststofffläschchen bevorzugt, da die ersten eine bessere Sichtbarkeit bieten, für eine Draufsicht auf den Muskel in den Lösungen nach oben auf das Stereoskop gelegt werden können, mehr Platz für die Verreibung der Muskeln länger und voluminöser als die FDB bieten und resistent gegen Kratzer sind, die durch die Glaspasteurpipetten verursacht werden. Da Alter, Gewicht und Stoffwechselzustand (z. B. gesunde vs. fettreiche Fettleibigkeit) die Effizienz der Methode beeinflussen, könnten mehrere Parameter optimiert werden müssen, wenn mit Tieren außerhalb des in diesem Manuskript verwendeten Bereichs gearbeitet wird. Wichtig ist, dass eine milde Exposition eines Muskels gegenüber bestimmten Enzymen, wie sie hier verwendet werden, und ein korrektes Dissoziationsverfahren die Fasern nicht funktionell beeinflussen, wie Beweise zeigen, die über Jahrzehnte von mehreren Gruppen gesammelt wurden, von denen einige vor einigen Jahren zusammengefasst wurden49. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass der mit schnellenCa2+-Farbstoffen während eines Zuckens gemessene Peak [Ca2+], der in manuell präparierten Bündeln und enzymatisch dissoziierten Fasern von Mäusen erhalten wurde, als vergleichbar angesehen werden kann (überprüft in 47).

Obwohl es andere Modelle für muskelbiologische Studien gibt, wie z. B. C2C12-Myotuben, normale und mutierte menschliche Myoblastenzelllinien oder aus pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnene Fasern 31,39,50,51,52,53, sind sie unausgereift und werden hier nicht diskutiert. Permeabilisierte oder gehäutete Fasern sind ebenfalls informative, gut charakterisierte Modelle54,55, aber sie sind nicht intakt. Das Modell der manuell isolierten Fasern bietet mehrere Vorteile, wie an anderer Stellevorgestellt 20, hat jedoch einen geringen Wirkungsgrad und erfordert eine hohe Ausbildung. Diese Tatsachen unterstreichen, dass das hier interessierende Modell - Fasern, die durch enzymatische Dissoziation gewonnen werden - die Möglichkeit bietet, intakte, reichlich vorhandene, reife Skelettmuskelfasern verschiedener Art zu erhalten. Eine Einschränkung des Modells besteht jedoch darin, dass das Fehlen von Sehnen die direkte Beurteilung der kontraktilen Eigenschaften in den isolierten Fasern einschränkt.

Da die Länge der Fasern nicht mit der Länge der Muskeln14,42 übereinstimmt und die Fasern die Experimentiereinheit sind, ist es relevanter, die Länge der Fasern zu klassifizieren, nicht die der Muskeln. Angesichts unserer Ergebnisse und ihrer potenziellen experimentellen Implikationen können die FDB-Fasern als kurz (<1 mm) klassifiziert werden; PDQA und PL als Zwischenprodukt (1 bis 3 mm); und EDL, EHL und Soleus als lang (>3 mm). Kurze Fasern sind am einfachsten und am häufigsten erhältlich (~400-500 Fasern pro Maus) und eignen sich für Fluoreszenzmikroskopie-Experimente, bei denen die Befestigung der Faser an der unteren Kammer entscheidend ist oder wenn Bewegungsartefakte vermieden werden müssen (z. B. Ca2+-Transienten). Lange Fasern sind am schwierigsten zu erhalten, haben die niedrigste Wiedergabe und eignen sich besser für die Proteinexpression mit Trenntechniken oder molekularbiologischen Einzelzellstudien. Intermediäre Fasern können nach moderatem Training in einer guten Menge (~50 Fasern pro Maus) gewonnen werden und eignen sich für viele experimentelle Ansätze, wie z.B. die Experimente der Ca2+ Transienten gezeigt haben. In Anbetracht der Tatsache, dass FDB, EDL und Soleus bereits zuvor verwendet wurden, ist dies die erste Arbeit, bei der Fasern aus den PDQA-, PL- und EHL-Muskeln erfolgreich isoliert wurden, wodurch die Verfügbarkeit von Modellen für reife Skelettmuskelstudien erhöht wurde. Darüber hinaus stellt die Gewinnung von Fasern aus verschiedenen Muskeln sicher, dass mehr Informationen von demselben Tier erhalten werden, wodurch die experimentelle Variabilität verringert, die statistische Aussagekraft und die biologische Solidität der Schlussfolgerungen erhöht und die Anzahl der für Experimente verwendeten Tiere verringert wird.

Generalisierbarkeit der Kinetik von Ca2+ -Transienten
Bei der Analyse der Kinetik der Ca2+-Transienten in reifen Skelettmuskelfasern von Säugetieren haben wir zuvor gezeigt, dass Fasern Typ I und IIA den sogenannten Morphologietyp I (MT-I) teilen, während Fasern IIX und IIB die MT-II-Morphologie teilen. Typischerweise haben MT-II-Signale eine RT von weniger als 1,2 ms, eine DT von weniger als 25 ms, A1 von mehr als 30 %, [Ca2+] über 15 μM und sind leicht in FDB- und EDL-Fasern zu finden33,47. Nach dem Vergleich der Ergebnisse der neuartigen Ca2+-Transienten von PDQA, PL und EHL mit den hier gefundenen und den zuvor für FDB und EDL veröffentlichten Ergebnissen ist es einfach zu schlussfolgern, dass sie alle auch MT-II sind. Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass die Erhöhung der Verfügbarkeit neuer Muskeln, die mit Fasern vom Typ IIX und IIB angereichert sind, als Modelle zur Gewinnung dissoziierter Fasern es ermöglicht, zu bestätigen, dass die Kinetik der Ca2+-Transienten verallgemeinert werden kann - Typ-IIX- und IIB-Fasern haben die MT-II unabhängig von ihrer Quelle (d. h. Flexoren (FDB), Extensoren (EDL und EHL), oder peronei (PDQA und PL)). Dies stärkt die Idee eines etablierten genzellulären Programms oder Profils der ECC-Maschinerie, das in allen Fasern desselben Typs ziemlich ähnlich ist, und dass Unterschiede in der molekularen Maschinerie (d. h. Isoformen und Proteinmenge), die der Erzeugung von Ca2+-Transienten zugrunde liegen, die Unterschiede in den Morphologien erklären, die zwischen den Fasernberichtet wurden 33. Schließlich ist eine praktische Implikation, dass es durch die Aufzeichnung des Ca2+-Transienten einer Faser mit Mag-Fluo-4 möglich ist, ihren Typ zuverlässig zu kennen.

MHC-Expression in Muskeln und isolierten Fasern: Implikationen für Fasertypen, die in physiologischen Experimenten verwendet werden
Die Kenntnis der Art der Ballaststoffe erhöht die Zuverlässigkeit der Muskelforschung. Zum Beispiel kann bei Knockout-Mäusen eines Proteins, das nach Fasertypen unterschiedlich exprimiert wird, die Verwendung von FDB-Fasern ohne Typisierung zu irreführenden Ergebnissen führen. Unsere Daten bestätigen, dass der FDB ein gemischter Muskel mit einer Dominanz von Typ-IIX-Fasern ist, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten 25,31,56. Noch wichtiger ist, dass es eine hohe Übereinstimmung zwischen dem Anteil der im gesamten Muskel vorhandenen Fasertypen und dem nach der Dissoziation erhaltenen gab. Da diese Informationen neu sind und normalerweise nicht in Arbeiten mit FDB-Fasern diskutiert werden, kann spekuliert werden, dass zufällig viele Ergebnisse, die in dissoziierten FDB-Fasern erzielt wurden, tatsächlich gemischte Informationen von ~20-25% von Fasern Typ I und 75-80% von Typ II widerspiegeln könnten. Zukünftige Studien mit FDB-Muskeln sollten Daten und die entsprechende Diskussion in Bezug auf Fasertypen präsentieren.

Da Soleus stark mit oxidativen Fasern vom Typ I, IIA und I/IIA angereichert ist 57,58,59, sind dies die Fasern, die nach der Dissoziation in der Suspension gefunden werden 33. EDL, ein weiterer bekannter Muskel, ist fast frei von Typ-I-Fasern57,58,59, so dass nach der Dissoziation nur schnelle Fasern entstehen33. Nach der gleichen Logik und gemäß den Typisierungsergebnissen, die eine Anreicherung von Typ-II-Fasern in den drei neuen Muskeln zeigen, weiter unterstützt durch die Tatsache, dass die wenigen Typ-I-Fasern, die in den Peronei-Muskeln der Maus gefunden werden, zentral60 sind und nicht erwartet werden, dass sie während einer milden Dissoziation erreicht werden, stellen wir die Hypothese auf, dass die Wahrscheinlichkeit, eine schnelle IIX- oder IIB-Faser in einem Experiment mit dissoziierten PDQA-Fasern zu verwenden, PL oder EHL kann bis zu 80-90% betragen. Dies scheint nach den Daten der Ca2+-Transienten zuzutreffen, in denen keine MT-I-Signale gefunden wurden. Aufgrund ihrer Größe bieten diese Fasern den Vorteil, dass sie nach Abschluss eines Funktionsexperiments für die Typisierung geeignet sind. Darüber hinaus hilft die Spezifität von BTS für MHC II, zwischen Fasertypen zu unterscheiden und gleichzeitig Bewegungsartefakte zu entfernen. Schließlich war diese Fasertypisierungsmethode zwar mühsamer als die kürzlich beschriebenen optimierten61,62, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit.

Schlüsse
Die vorgestellten methodischen Details können die Verwendung einer Vielzahl enzymatisch dissoziierter Muskelfasern in der Untersuchung der Muskelbiologie fördern. Die Vielseitigkeit des Modells wird durch die Möglichkeit unterstützt, Fasern in einem großen Bereich von Längen und Typen zu erhalten und sie in mehreren experimentellen Anwendungen zu verwenden. Neben FDB, EDL und Soleus, über deren Dissoziation vor Jahren berichtet wurde, haben wir die Machbarkeit der Gewinnung von intermediären und langen Fasern aus anderen Muskeln wie PDQA, PL und EHL demonstriert. Angesichts der Leichtigkeit, mit der die Dissektion durchgeführt werden kann, und der Anzahl der Fasern, die erhalten werden können, sowie der Homogenität und Größe der Fasern schlagen wir PL als routinemäßiges, geeignetes Modell für reife Skelettmuskelstudien vor. Dies wird durch unsere Ergebnisse unterstützt, dass die Kinetik der Ca2+ -Transienten im Skelettmuskel unabhängig von ihrer Quelle verallgemeinert werden kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Professor Robinson Ramírez von UdeA für die Hilfe mit Tieren und einigen Fotos und Carolina Palacios für die technische Unterstützung. Johan Pineda von Kaika half uns beim Aufbau der Farb- und Fluoreszenzkameras. Shyuan Ngo von der University of Queensland hat das Manuskript freundlicherweise Korrektur gelesen. Diese Studie wurde von der CODI-UdeA (2020-34909 vom 22. Februar 2021 und 2021-40170 vom 31. März 2022, SIU) und dem Planungsbüro-UdeA (E01708-K und ES03180101), Medellín, Kolumbien, an JCC finanziert. Die Geldgeber beteiligten sich nicht an der Datenerhebung und -analyse, dem Schreiben von Manuskripten oder der Einreichung von Manuskripten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie Ausgabe 202 Skelettmuskel Muskelfasern Fasertypen Ca2+ Erregungs-Kontraktions-Kopplung Immunfluoreszenz Myosin-Schwerkette
Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis
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Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

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