Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

סיבי שרירי השלד המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שרירי העכבר הם מודל שימושי לניסויים פיזיולוגיים. עם זאת, רוב המאמרים עוסקים בסיבים הקצרים של ה-FDB (flexor digitorum brevis), המגבילים את טווח התוצאות העוסקות בסוגי סיבים, מגבילים את כמות החומר הביולוגי הזמין ומונעים קשר ברור בין תופעות פיזיולוגיות תאיות לבין ידע ביוכימי ודינמי קודם שהושג בשרירים אחרים.

מאמר זה מתאר כיצד להשיג סיבים שלמים משישה שרירים בעלי פרופילים ואורכים שונים של סוגי סיבים. באמצעות C57BL/6 עכברים בוגרים, אנו מראים את פרוטוקול דיסקציית השרירים ובידוד הסיבים ומדגימים את התאמת הסיבים למחקרים חולפים Ca2+ ואפיונם המורפומטרי. הרכב סוג סיבים של השרירים מוצג גם. כאשר מנותקים, כל השרירים נותרו שלמים, סיבים חיים המתכווצים במהירות במשך יותר מ -24 שעות. FDB נתן קצר (<1 מ"מ), peroneus digiti quarti (PDQA) ו peroneus longus (PL) נתן ביניים (1-3 מ"מ), בעוד extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), ושרירי סולאוס שחררו סיבים ארוכים (3-6 מ"מ).

כאשר תועדו עם הצבע המהיר Mag-Fluo-4, Ca2+ transients של סיבי PDQA, PL ו-EHL הראו קינטיקה מהירה וצרה המזכירה את סוג המורפולוגיה II (MT-II), הידוע כמתאים לסיבים מסוג IIX ו-IIB. זה עולה בקנה אחד עם העובדה כי שרירים אלה יש מעל 90% של סיבים מסוג II לעומת FDB (~ 80%) ו soleus (~ 65%). מעבר ל-FDB, אנו מדגימים לראשונה דיסוציאציה של מספר שרירים, היוצרים סיבים המשתרעים על פני טווח אורכים שבין 1 ל-6 מ"מ. סיבים אלה הם קיימא ונותנים Ca2+ מהיר transients, המציין כי MT-II ניתן להכליל סיבים מהירים IIX ו- IIB, ללא קשר למקור השריר שלהם. תוצאות אלה מגדילות את הזמינות של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

Introduction

שריר השלד הבוגר של יונקים הוא רקמה רב תכליתית. הוא מווסת בכבדות את חילוף החומרים, הוא המקור העיקרי לייצור חום, ותכונותיו הדינמיות מעניקות לו תפקיד מפתח בנשימה, תנועה של מקטעי גוף, או תזוזה מנקודה אחת לאחרת 1,2,3. שרירי השלד רלוונטיים גם לפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל מצבים תורשתיים וכרוניים, כגון מיופתיות, ניוון או סרקופניה, כמו גם מצבים כרוניים רבים שאינם שרירים, כגון מחלות לב מטבוליות 3,4,5,6,7,8.

מחקר ex vivo של התכונות המבניות והתפקודיות של שרירי שלד בוגרים בהקשר של בריאות ומחלות התאפשר בעיקר באמצעות שני מודלים ניסיוניים: שריר שלם וסיבים מבודדים. במאהה-20, חוקרים ניצלו את התכונות של השרירים השלמים, השלמים extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ו-gastrocnemius של מינים קטנים שונים כמודלים מרכזיים כדי ללמוד על יחידות מוטוריות, סוגי סיבים ותכונות דינמיות כגון כוח וקינטיקה של כיווץ והרפיה 9,10,11,12,13,14,15,16. עם זאת, הופעתם של מחקרים מעודנים יותר בביולוגיה של התא העבירה את האזור לחקר סיבי שריר בודדים. עבודה חלוצית אפשרה אז בידוד של סיבי flexor digitorum brevis (FDB) שלמים של חולדות על ידי דיסוציאציה אנזימטית לצורך אפיון עוקב 17,18,19. למרות סיבי FDB ניתן להשיג גם על ידי דיסקציה ידנית20, הקלות והתפוקה הגבוהה של דיסוציאציה אנזימטית של שרירי מורין, בנוסף להתאמתם למגוון גישות ניסיוניות, הפכו את המודל האחרון בשימוש נרחב במהלך שני העשורים האחרונים.

סיבי ה-FDB הקצרים מתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביופיזיקליים אחרים, ניתוחים ביוכימיים, מטבוליים ופרמקולוגיים, ניסויים במיקרוסקופ אלקטרונים ופלואורסצנטיים, טרנספקציה לגישות ביולוגיה של התא, או כמקור לתאי גזע במחקרי מיוגנזה 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. עם זאת, שימוש רק בסיבי FDB בניסויי שרירים מצמצם את היקף המחקר העוסק בסוגי סיבים ומגביל את כמות החומר הביולוגי הזמין לטכניקות מתודולוגיות מסוימות או להשגת מידע נוסף מחיה אחת. מגבלות אלה מעכבות התאמה ברורה של תופעות פיזיולוגיות תאיות עם מחקרים ביוכימיים ודינמיים קודמים שבוצעו בשרירים שלמים ושלמים שונים (למשל, EDL, soleus, peronei).

התגברות על מגבלות אלה, קבוצות מסוימות הצליחו לנתק את שרירי EDL וסוליאוס הארוכים יותר 24,33,34,35,36,37,38,39,40, ובכך פתחו את הדלת להרחיב עוד יותר את השיטה לשרירים רלוונטיים אחרים. עם זאת, השימוש בסיבי EDL ו-soleus עדיין נדיר, ככל הנראה בשל היעדר פרטים מתודולוגיים לקבלת סיבים שלמים. כאן, אנו מתארים בפירוט כיצד לבודד סיבים באורכים וסוגים שונים משישה שרירים: שלושה מהם כבר תוארו (FDB, EDL, ו soleus) ושלושה מהם בהצלחה מנותקים בפעם הראשונה (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL], ו peroneus digiti quarti [PDQA]). תוצאות העבודה הנוכחית מאשרות כי המודל של סיבים מנותקים אנזימטית מתאים למגוון רחב של מחקרים ומתאמים עתידיים עם נתונים שפורסמו בעבר, ובכך מגדיל את זמינותם של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה בניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת אנטיוקיה (UdeA) (פרוטוקול 104 מיום 21 ביוני 2016 ו-005 מיום 15 באפריל 2021), על פי חוק 84 משנת 1989 והחלטה 8430 משנת 1993 שהונפקו על ידי ממשלת קולומביה ובוצעו ודווחו בהתאם למחקר בבעלי חיים: הנחיות דיווח בניסויי Vivo (ARRIVE)41. כל התוצאות המוצגות כאן מגיעות מעכברים בריאים, בני 7-13 שבועות, 20-26 גרם, C57BL/6 זכרים. איור 1 מראה את העיצוב הכללי של מחקר זה ואת סדר ההליכים. כל הריאגנטים, החומרים ופרטי הציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים

  1. אכלסו עד שישה עכברים לכלוב אקרילי, שקוף, מלבני, עם מצעים מעץ, בתנאים של טמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 מעלות צלזיוס) ומחזורי אור:חושך (12:12 שעות).
  2. תנו לבעלי החיים גישה חופשית למזון ומי ברז במתקנים ספציפיים לבעלי חיים נטולי פתוגנים ללא העשרה סביבתית.

2. דיסקציה

  1. פתרונות, חומרים וריאגנטים
    1. הכן וסנן (0.22 מיקרומטר) את פתרונות העבודה עם ההרכב הבא (כל הריכוזים ב- mM):
      1. טירוד: 5.4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 גלוקוז, 10 HEPES, pH 7.3
      2. דיסוציאציה: 2.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 0.5 MgCl2, 138 NaCl, 0.1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7.4
      3. מלח חוצץ פוספט (PBS): 137 NaCl, 8.6 Na2HPO4, 2.8 KH2PO4, pH 7.34
    2. הכינו שני תאי נתיחה; סטריאוסקופ; הפעלת מספריים; מספריים עדינים; מלקחיים עדינים; ובקבוקוני זכוכית נקיים, שקופים, לא חרוטיים, ברוחב 1-1.5 ס"מ, בנפח כולל של 3-4 מ"ל עם מכסים. סדרו מערכת לגירוי חשמלי של השרירים בתאי הדיסקציה.
    3. הכינו פיפטות זכוכית פסטר מלוטשות אש ברוחב שונה: 5, 4, 3, 2 ו-1 מ"מ.
    4. הגדר את אמבט המים ל 37 °C (77 °F). לשקול aliquots של 3 מ"ג של collagenase סוג 2.
  2. פרוצדורה
    1. להקריב את העכבר בשיטות שאושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. פריקת צוואר הרחם מומלצת מכיוון שהיא מהירה, פחות מלחיצה ונמנעת מחשיפה לתרופות, שעלולות להשפיע על רקמת השריר (כגון CO2 או חומרי הרדמה מסוימים). התחל בנתיחה באופן מיידי כדי להשיג תוצאות טובות יותר.
    2. הנח את העכבר על משטח קצף והדביק או נעץ את הגפיים הקדמיות. חותכים את שתי הגפיים האחוריות מעל הברכיים עם מספריים ניתוח, מעבירים כל אחד מהם לתא דיסקציה נפרד, ומוסיפים טיירוד קר (10-20 מעלות צלזיוס) כדי לכסות את הרקמה.
      הערה: כל גפה אחורית תיתן שישה שרירים שונים בסדר הבא: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ו- PDQA. התייחסויות אנטומיות מפורטות לניתוח ששת השרירים השלמים מגיד לגיד ניתנות באיור 2 ובמקומות אחרים42.
    3. הצמד את הגפה האחורית הראשונה לחדר הדיסקציה במצב שבו הפנים האחוריות של הרגליים גלויות. הסר את העור תחת הגדלה; לאחר מכן חשפו והסירו את ה-FDB (איור 2). אחסנו אותו בבקבוקון זכוכית מסומן אחד עם 1 מ"ל של תמיסת Tyrode.
      הערה: יש צורך בהגדלה מתאימה ובאימונים קודמים כדי למנוע חתך לא רצוי ברקמת השריר.
    4. חשוף, הסר ואחסן את הסולאוס בבקבוקון נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode. השתמשו במספריים עדינים כדי להפריד תחילה את הגסטרוקנמיוס ולאחר מכן כדי להסיר את הסולאוס כפי שמצוין באיור 2.
    5. לחשוף את הפנים הקדמיות של הרגל, להסיר את העור, ולזהות את הגידים הדיסטליים של שרירי טיביאליס הקדמיים ואת שרירי EDL בקרסול. הסר והשליך את tibialis; לאחר מכן חתכו את הגידים הדיסטליים של ה-EDL (איור 2). המשך בדיסקציה עד להסרת ה-EDL והניחו אותו בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של טירוד.
    6. הסר את שריר ה- EHL, שנמצא רק אחורי ומדיאלי ל- EDL. התחל את הדיסקציה על-ידי זיהוי הגיד ומעקב אחריו לספרה1 , כפי שמצוין בלוח המתאים באיור 2. שמור את השריר בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
    7. זהו ועקבו אחר הגיד החיצוני ביותר של הפרוני כדי לחתוך אותו ולהסיר את שריר ה-PL (איור 2). מניחים את השריר בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
    8. לזהות ולעקוב אחר הגידלספרה 4 ; חתכו אותו והוציאו את שריר ה-PDQA (איור 2). מניחים אותו בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
    9. חזור על ההליך עם הגפה האחורית השנייה.
    10. אספו את שני השרירים מאותו סוג בבקבוקון זכוכית מסומן אחד או בצלחת פטרי קטנה עם תמיסת טירוד.
      הערה: אם מתוכננים לנתח יותר משני זוגות שרירים במהלך פגישת עבודה, גייסו שני חוקרים להליך הנתיחה.

3. פרוטוקול בידוד סיבי שריר

  1. חדש את תמיסת Tyrode בתאי הדיסקציה כדי להסיר פסולת ופרוות עכבר. יוצקים את שרירי ה- FDB לתא דיסקציה אחד, מאמתים את שלמותם ומעבירים אותם לבקבוקון זכוכית חדש עם 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה. חזור על הליך זה עם שרירי EHL, PL ו- PDQA.
    הערה: אם שריר נראה מכווץ יתר על המידה, חתוך או אינו מגיב לגירוי החשמלי, אל תמשיך לשלב הפרוטוקול הבא. במקום זאת, מטבו את פרוטוקול הדיסקציה על-ידי אימות איכות התמיסות (pH, זיהום, אוסמולריות) ורכישת מיומנויות דיסקציה נוספות (איור 1C ווידאו משלים S1).
  2. בצעו חתכים אורכיים או אלכסוניים בשרירי הסולאוס וה-EDL, בהתאם לכיוון הסיבים (איור 2). עבור הסוליאוס, בצע את הגיד המרכזי, חיתוך ~ 80% מאורכו. עבור EDL, פשוט בצע גיד אחד או שניים וחתך בערך באותו אורך כמו עבור soleus. שים כל זוג שרירים בבקבוקוני זכוכית עם 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה.
    הערה: הליך זה הופך את ה-EDL והסוליאוס לקטנים יותר ומאפשר לקולגנאז להיכנס טוב יותר לרקמה. הגדלה מספקת (40-50x), כמו גם מספריים ומלקחיים עדינים, הם חובה. בדוק תמיד את שלמות הדגימה על ידי בדיקה חזותית וגירוי חשמלי לפני שתמשיך לשלב הבא של פרוטוקול הדיסוציאציה.
  3. יש להוסיף 3 מ"ג של collagenase סוג 2 (עם פעילות של 250-300 U / mg) לכל בקבוקון המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה וזוג שרירים. תקנן את הכמות המדויקת של collagenase על ידי התחשבות בפעילות של אצווה האנזים בשימוש.
  4. לדגור על זוגות השרירים באמבט המים במשך 65-90 דקות ב 36.8-37 מעלות צלזיוס, עם רעד עדין.
    הערה: יש להקפיד על בקרת הטמפרטורה. סטנדרטיזציה של ההליך כך השרירים לא להישאר collagenase במשך יותר מ 100 דקות כדי למנוע נזק.
  5. בדוק את הבקבוקונים תחת הגדלה סטריאוסקופית כל 5 דקות לאחר הדקה ה- 65 של הדגירה. כאשר השרירים נראים מעט אדווה, מרופטים ומשוחררים, נערו בעדינות את הבקבוקון וודאו אם חלק מהסיבים מתחילים להתנתק בקלות. אם זה המקרה, לשטוף את השרירים עם Tyrode בטמפרטורת החדר כדי להשבית ולהסיר את collagenase.
    הערה: יש לבצע שטיפה בזהירות, מבלי לגעת בשרירים עם הפיפטות. התחל על ידי הוספת 0.8 מ"ל של Tyrode ולאחר מכן להסיר 0.8 מ"ל של הפתרון. חזור על הליך זה 4-5x וודא שהפתרון הופך לשקוף לחלוטין.
  6. מפרידים יותר סיבים מעיקר השרירים עם טריטורציה עדינה מאוד בטירוד בעזרת סט פיפטות פסטר מלוטשות אש. התחל על ידי תסיסה סביב השריר עם פיפטה רחבה ביותר (5 מ"מ קצה) ולאחר מכן בעדינות למשוך את השרירים למעלה לתוך פיפטה והחוצה 3-4x. כאשר השריר מתחיל לשחרר סיבים ונעשה דק יותר, חזור על התהליך עם פיפטה הבאה (4 מ"מ קצה).
    הערה: סיבים המעובדים באמצעות הליך זה נשארים מעוררים ומתכווצים במהירות במשך יותר מ-24 שעות, כפי שמודגם באמצעות סיבי PL, EDL, EHL ו-soleus ב-Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 ו-Supplemental Video S5.

4. הליכים ניסיוניים

הערה: סיבים מבודדים שימשו להערכות ריכוז סרקופלזמיות Ca2+ , מדידות מורפומטריות ומחקרי ביטוי שרשרת כבדה מיוזין (MHC).

  1. מדידה של Ca סרקופלזמי2+ ריכוז במהלך עווית
    1. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה על תא האמבטיה הניסיוני. מצפים את המגלשה עם 2-3 μL של למינין ומאפשרים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שפכו ~ 400 μL של תרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הרכיבו את תא הניסוי על במה של מיקרוסקופ הפוך המצויד באפיפלואורסנציה (איור 3A).
    3. עורר עוויתות בודדות כדי לאמת את הכדאיות של הסיבים על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 אלפיות השנייה) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי. גם כאשר מחוברים ללמינין, התכווצות הסיבים עדיין ניכרת בעיקר בקצוות.
    4. טען את הסיבים עם 3.5-4.5 מיקרומטר של צבע Ca2+ המהיר Mag-Fluo-4, AM במשך 4-5 דקות בתמיסת Tyrode. לאחר זמן זה, לשטוף בעדינות עם Tyrode כדי להסיר את הצבע החוץ תאי. אפשר לצבע התוך-תאי לעבור דה-אסטריפיקציה למשך ~15-20 דקות בתנאים כהים. תמיד לשמור על הטמפרטורה מתחת 22 °C כדי למנוע את מידור הצבע.
      הערה: הכינו מלאי של Mag-Fluo-4, AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בלבד, כך שהריכוז הסופי של DMSO בתמיסת Tyrode הטעינה יהיה פחות מ-0.5%.
    5. האר את הסיב באמצעות דיודה פולטת אור לבנה (LED) ומסנן עם אורכי הגל הבאים לעירור/דיכרואיק/פליטה: 450-490/510/515 ננומטר (איור 3A).
      הערה: מקורות עירור חלופיים כוללים מנורות פלואורסצנטיות של כספית וקסנון. השתמש בעוצמה ובגודל הנמוכים ביותר האפשריים של נקודת העירור כדי למנוע הלבנה של הצבע ונזק לתא.
    6. עורר את תגובת Ca2+ של הסיב (סרקופלזמי Ca2+ transients) על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 מילישניות) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי ב 20-22 ° C.
    7. אספו ושמרו את אותות האור באמצעות טבילת שמן למרחקים ארוכים פי 40 המתאימה לפלואורסצנטיות וצינור מכפיל אור (PMT) המחובר לדיגיטציה (איור 3A ווידאו משלים S6). ודא קנה מידה בתוכנת הרכישה של 0-200 יחידות שרירותיות (AU) והגדר את פלואורסצנטיות המנוחה (Frest) של הניסוי ל- 10 AU בסולם זה על ידי ויסות גודל נקודת העירור והרווח של PMT. לאחר שההליך מתוקנן, שמור על הרווח ללא שינוי מניסוי אחד לשני וקבע את קנה המידה רק באמצעות התאמות קלות בגודל הספוט.
      הערה: אם מתעוררים תוצרי תנועה, השתמש ב- 20-30 מיקרומטר N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) בתמיסת Tyrode.
    8. נתח וכייל את האותות באופן הבא:
      1. Lowpass מסנן את כל המעקב ב- 1 kHz.
      2. חשב את מנוחת F ב- 1 שניות של העקבה, התאם את משענת F ל- 0, ומדוד את שיא המשרעת הסרקופלזמית Ca2+ transients ' (שיא F). הצג את המשרעת כמו במשוואה (1):
        Equation 1(1)
      3. חשב את שיא ריכוז Ca2+ ([Ca2+], μM) באמצעות משוואה (2)26 והפרמטרים הבאים: קבוע דיסוציאציה באתרו (Kd) = 1.65 × 105 מיקרומטר2, פלואורסצנטיות מקסימלית (Fmax) של 150.9 AU, פלואורסצנטיות מינימלית (Fmin) של 0.14 AU, ריכוז Mag-Fluo-4 [D]T של 229.1 מיקרומטר26. שיא F הושג כבר בשלב 4.1.8.2.
        Equation 2(2)
      4. מדוד את זמן העלייה מ- 10% ל- 90% מהמשרעת (RT, ms), את משך הזמן בחצי מקסימום (HW, ms) ואת זמן הדעיכה מ- 90% עד 10% מהמשרעת (DT, ms). לאחר מכן, הערך את קינטיקה הדעיכה על פי התאמה עם הפונקציה הדו-מעריכית (משוואה 3):
        Equation 3(3)
      5. שמור את הערכים של קבועי הזמן של דעיכה τ1 ו- τ2 (ms) ומשרעת A1 ו- A226.
  2. מדידות מורפומטריות
    1. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה על תא האמבטיה הניסיוני. מצפים את המגלשה עם 2-3 μL של למינין ומאפשרים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שפכו ~ 400 μL של תרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. עורר עוויתות בודדות כדי לאמת את הכדאיות של הסיבים על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 אלפיות השנייה) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי. גם כאשר מחוברים ללמינין, התכווצות הסיבים עדיין ניכרת בעיקר בקצוות.
    3. קבל תמונות של הסיבים החיים באמצעות מטרות 10x ו 20x ומצלמה של לפחות 5 מגה פיקסל רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. אחסן את התמונות ב- . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בקבוצה של ~2-6 תמונות כדי ללכוד לחלוטין סיב ארוך.
    4. דמיינו סרגל כיול מיקרומטר של מיקרוסקופ תחת אותה הגדלה. אחסן את התמונות ב- . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
    5. מדוד את האורכים והקטרים של הסיבים באמצעות כלי הכיול של תוכנה חופשית לניתוחי תמונות באופן הבא:
      1. קבעו קשר בין פיקסלים למרחק הידוע (מיקרומטר) בתמונות בעזרת סרגל כיול המיקרומטר של המיקרוסקופ בעזרת הכלי ניתוח/קביעת קנה מידה כפי שמוצג באיור S1 המשלים.
      2. מדדו אורכים פעם אחת מקצה אחד לשני של הסיב ואת הקטרים ב-2-6 מקומות שונים לאורך הסיב (1-2 מדידות לכל תמונה, בהתאם לאורכו), כמו באיור משלים S1.
      3. דווח על ערך האורך (מיקרומטר או מ"מ) והממוצע של כל הקטרים (מיקרומטר) שנמדדו לסיב.
  3. מחקרי הבעת שרשרת כבדה של מיוסין
    הערה: לפרטים על קביעת MHC על ידי immunofluorescence43 ואלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)33,44,45,46 בשרירים שלמים, ראה קובץ משלים 1. הפרוטוקול להקלדת סיבים על ידי קביעת אימונופלואורסנציה של MHC בתרחיף של סיבים מבודדים FDB הוא כדלקמן:
    1. צפו כל אחת מחמש מגלשות זכוכית נקיות ב-2-3 מיקרוליטר למינין והניחו לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שתשפכו ~300 מיקרוליטר של תרחיף הסיבים על כל מגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. תקנו את התכשירים עם אצטון מקורר במקפיא למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS.
    4. חדרו את קרומי התאים עם PBS בתוספת 0.7% Triton X-100 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS בתוספת אלבומין בסרום בקר 0.2% (BSA) ו-0.04% Triton X-100, ולאחר מכן לחסום עם PBS עם 2% BSA, 2% סרום עיזים ו-0.4% Triton X-100 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS בתוספת 0.2% BSA ו-0.04% Triton X-100 ולדגור עם הנוגדנים העיקריים באופן הבא:
      1. יש לדלל כל נוגדן ראשוני נגד MHC בבקבוקון נפרד ב-PBS עם 1% BSA ו-0.04% Triton X-100: anti-I (1:1,500), anti-II (1:600), anti-IIA (השתמש במדיה מותנית שלמה מההיברידיומה) ו-anti-IIB (1:500).
      2. לדגור על כל שקופית עם נוגדן אחד ואת השקופית הנותרת עם PBS כבקרה במשך 12-16 שעות ב 4 ° C.
        הערה: בפרוטוקול זה, סיבים מסוג IIX נותרו ללא תווית בכל הדגימות.
    7. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS ולדגור על כל המגלשות עם הנוגדן המשני (1:800) המחובר למולקולה ירוקה פלואורסצנטית למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
    8. גרעיני צביעה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst למשך 15 דקות.
    9. יש לשטוף בעדינות 3x עם PBS, להוסיף בזהירות 20-40 μL של אמצעי הרכבה, ולהניח כיסוי.
      הערה: החלפת תמיסה עדינה ושטיפה מבטיחים שעשרות סיבים יישארו מחוברים לשקופית, מה שהופך את הניסוי למבוסס סטטיסטית.
    10. דמיינו כל שקופית באמצעות מטרה של 10x המתאימה לפלואורסצנטיות ומסנן עם אורכי הגל הבאים לעירור/דיכרואי/פליטה: 450-490/510/515 ננומטר וספרו את כל הסיבים החיוביים והשליליים. לחלופין, לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות אותם תנאים טכניים ומצלמה של לפחות 5 מגה פיקסל רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולאחסן אותם ב . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
    11. רשום את הסיבים החיוביים והשליליים של כל שקופית במסד נתונים וחשב את האחוזים של סיבי I, IIA, IIB ו- Total II חיוביים בהתבסס על המספר הכולל של סיבים הקיימים בשקופית המתאימה. חשב את אחוז סיבי IIX על-ידי הפחתת הסכום של IIA+IIB מהאחוז הכולל של סיבי II. הערך את אחוז סיבי I/IIA היברידיים על-ידי הפחתת הסכום של I+II מערך של 100%. לבסוף, הפחיתו את אחוז התאים ההיברידיים מהסכום הכולל של I ו- II כדי לקבל סיבים טהורים מסוג I ו- II.
      הערה: במחקרי הרכב MHC, סוגי סיבים מסומנים באות גדולה ואילו איזופורמים מסומנים באות קטנה46.
  4. צביעת המטוקסילין ואאוזין
    1. מצפים מגלשת זכוכית נקייה ב-2-3 מיקרוליטר למינין ומניחים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני ששופכים ~300 מיקרוליטר מתרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. מקבעים את התכשיר בתמיסה של קרנוי (60% אתנול מוחלט, 30% כלורופורם, 10% חומצה אצטית) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לדגור עם hematoxylin במשך 90 שניות.
    4. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים במי ברז.
    5. לדגור עם 1% eosin Y מוכן 70% אתנול במשך 30 שניות.
    6. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים במי ברז.
    7. לטבול פי 3 לתוך אתנול מוחלט.
    8. לדגור בקסילול במשך 60 שניות.
    9. הוסף 20-40 μL של מדיום הרכבה ולדמיין עם מיקרוסקופ קונבנציונאלי. קבל תמונות בהגדלה הרצויה באמצעות מצלמה צבעונית של לפחות 5 מגה פיקסל.

5. ניתוחים סטטיסטיים וגרפים

הערה: יחידת הניסוי היא סיב שריר.

  1. הצג תוצאות כממוצע ± סטיית תקן וחשב רווחי סמך 95% (CI95%) עבור ניתוחים מסוימים.
  2. כדי להשוות אורך, קוטר וקינטיקה של Ca2+ transients בין קבוצות, בצע ניתוח שונות (ANOVA) ובדיקות פוסט-הוק עם תיקון של Bonferroni.
  3. להעריך נורמליות ושוויון שונות באמצעות מבחני שפירא-וילק ולוין, בהתאמה.
  4. שקול את ההבדלים משמעותיים כאשר p < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ריכוז סרקופלזמי Ca2+ במהלך עווית
כדי להדגים את ההיתכנות של ניסויים פיזיולוגיים בקבוצת סיבים מנותקים ולהרחיב את הממצאים הקודמים שלנו על צימוד עירור-כיווץ (ECC) וסוגי סיבים, Ca2+ transients נרכשו בסיבים מכל השרירים. ראשית, FDB (n = 5) ו- EDL (n = 7) הראו קינטיקה Ca2+ המכונה מורפולוגיה מסוג II (MT-II). אלה הם אותות מהירים, קוצניים, אשר RT נמשך ~ 1 ms; שלב הדעיכה שלו יכול להיות מצויד בפונקציה דו-מעריכית כאשר הרכיב הראשון (A1) גדול מ-30% מהמשרעת כולה, והשיא שלו [Ca2+] הוא בין 15 ל-30 מיקרומטר33,47 (איור 3B). התוצאות שלהם מאוגדות (n = 12) בעמודה הראשונה של טבלה 1, בעוד שהתוצאות של הארעיים Ca2+ של הסולאוס (n = 6) מוצגות בעמודה השנייה של טבלה 1. אותות הסולאוס סווגו כמורפולוגיה מסוג I (MT-I, איור 3B) - רחב יותר, עם RT מעל 1.2 מילישניות, A1 נמוך מ-30%, ושיא [Ca2+] בין 7 ל-13 מיקרומטר33,47. שני טורים אלה נחשבו כסימוכין להשוואת מעברי Ca2+ של השרירים החדשים. מאחר שכל הסיבים מ-PDQA (n = 4), PL (n = 6) ו-EHL (n = 4) חלקו את MT-II (איור 3B), הנתונים שלהם מאוגרים (n = 14) בעמודה השלישית של טבלה 1. אותות אלה הראו RT ממוצע של ~1 מילישניות, A1 של ~45%, שיא [Ca2+] מעל 15 מיקרומטר, ומשווים היטב עם התוצאות המוצגות בעמודה הראשונה אך שונות בבירור מאלה המוצגות בטור השני, כפי שאושר על ידי הניתוח הסטטיסטי (טבלה 1). האות המהיר ביותר של כל הדגימה הגיע מסיב EHL, עם ΔF/F של 0.66, [Ca2+] של 16.99 מיקרומטר, RT של 0.85 אלפיות השנייה, HW של 2.42 מילישניות ו-DT של 10.56 אלפיות השנייה. τ1 ו-τ2 היו 1.63 ו-7.21 אלפיות השנייה, בהתאמה, בעוד שהערכים A1 ו-A2 היו 56.60% ו-43.40%. האות האיטי ביותר הגיע מסיב סוליאוס, עם ΔF/F של 0.41, [Ca2+] של 9.76 מיקרומטר, RT של 1.56 אלפיות השנייה, HW של 9.43 מילישניות ו-DT של 31.88 מילישניות. τ1 ו-τ2 היו 2.81 ו-96.42 אלפיות השנייה, בהתאמה, בעוד שהערכים A1 ו-A2 היו 19.55% ו-80.45%. 

סוללה של סיבים קצרים, בינוניים וארוכים
התצפית על הבדלים ברורים בין הסיבים בהתאם למקור השריר שלהם אפשרה אפיון מורפומטרי מלא יותר. ההיסטוגרמות של איור 4 מראות שינויים מרשימים באורכי הסיבים בכל השרירים. זה מודגש כאשר משווים את הסיב הקצר ביותר מ FDB (227.06 מיקרומטר) עם אחד הארוך ביותר מ soleus (5.69 מ"מ). ערכי האורך הממוצע מסוכמים בטבלה 2. נמצאו הבדלים סטטיסטיים מובהקים בין הקבוצות (p < 0.01). תוצאות אלה מאפשרות סיווג סיבי FDB כקצרים (<1 מ"מ); PDQA ו- PL כביניים (1 עד 3 מ"מ); ו-EDL, EHL ו-soleus באורך של >3 מ"מ (איור משלים S2).

לעומת זאת, נצפו הבדלים קלים בקטרים הממוצעים של סיבי כל השרירים (טבלה 2) ובהתפלגות הערכים (איור 4). עם זאת, היו הבדלים סטטיסטיים מובהקים בין הקבוצות (p < 0.01). כאשר הוערכו בפירוט, היו הבדלים בין FDB לבין שריר אחר ובין FDB (FDB 38.40 ± 9.40 מיקרומטר, n = 370) לבין מאגר הסיבים הבינוניים והארוכים (45.07 ± 9.99 מיקרומטר, n = 422, p < 0.05). התא הדק ביותר של כל הדגימה נמדד 18.42 מיקרומטר (FDB) והעבה ביותר הגיע ל-82.79 מיקרומטר (PDQA).

סוגי סיבים המשמשים בניסויים פיזיולוגיים
ראשית, סוגי הסיבים הקיימים בכל שריר שלם נקבעו על ידי immunofluorescence. למעט הסולאוס (soleus), השרירים הראו דומיננטיות של יותר מ-76% מהסיבים מסוג II (איור משלים S3, טבלה 3 וטבלה 4). EHL, PL ו-PDQA הם שרירים מהירים במיוחד, עם יותר מ-90% מהסיבים המהירים ועד 58.8% מהסיבים מסוג IIB, כפי שנמצא ב-PDQA. EHL ו-PDQA היו כמעט נטולי סיבים מסוג I. סיבי I/IIA היברידיים היו נוכחים בכל השרירים באחוזים נמוכים. כצפוי, סיבים מסוג I ו-IIA היוו מעל 82% מכלל סיבי הסולאוס (soleus). שריר זה כמעט נטול סיבי IIB המהירים ביותר. על פי הפרופיל של סוגי סיבים, הסולאוס הוא האיטי ביותר וה- PDQA הוא השריר המהיר ביותר מבין ששת הנבדקים.

לאחר מכן, ומכיוון שהוא רלוונטי יותר לניסויים פיזיולוגיים של סיבים בודדים, נדונה השאלה אילו סוגי סיבים מופיעים בתרחיף התא הנגזר מה-FDB המנותק. נמצא כי פרופיל הסיבים בתרחיף התא משקף את הרכב הסיבים הקיימים בהקפאה: שלושה מתוך ארבעה סיבים מנותקים היו מסוג II (איור 5 וטבלה 3).

לבסוף, הרכב השרירים אושר על ידי הפרדת איזופורמים MHC שלהם באמצעות SDS-PAGE. התוצאות היו עקביות עם הדפוס הכללי שנצפה בבדיקות immunofluorescence. הסולאוס הועשר ב-MHC IIa ו-I, בעוד שה-EDL, EHL והפרוני הועשרו ב-MHC IIx ו-IIb אך היו נטולי I (איור משלים S4).

Figure 1
איור 1: תכנון המחקר. (א) ציוד ופתרונות שיוקמו לפני תחילת הליך הנתיחה. 1. סטריאוסקופ מספר אחת. 2. מלמטה למעלה: סט של חמש פיפטות מלוטשות אש, כלי דיסקציה ובקבוקוני קולגנאז בתוך צידנית ניידת (מארז צהוב). 3. מארז סינון, תא נתיחה, בקבוקוני זכוכית מסומנים עם מכסה, מתלה עם פתרונות מסוננים. 4. כלי נתיחה. 5. סטריאוסקופ עם תא דיסקציה מספר שניים המחוברים למצלמה וממריץ חשמלי. (B) הליך הדיסקציה של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכברים, כפי שמוסבר באיור 2. (C) לאחר הדיסקציה יש לוודא את כיווץ השרירים ותקינתם לפני שממשיכים לשלב הפרוטוקול הבא. השריר השמאלי בפאנל השמאלי מראה שריר PL גלי, מכווץ יתר על המידה ולא מגיב (חץ כחול), אשר לא ישמש להשגת סיבים מנותקים. במקום זאת, פרוטוקול הדיסקציה צריך להיות ממוטב ולהתחיל מחדש. מקבילו PL מנותח היטב (שריר ימין בלוח השמאלי) מציג מראה מוארך ומתכווץ באופן גלוי (וידאו משלים S1). הפאנל מימין מראה שני שרירי EDL (חץ כחול) ושני שרירי FDB בתוך תמיסת הקולגנאז עם המראה הנכון והישר. (D) ברגע שהשרירים מנותקים, שפכו את הסיבים המבודדים לתוך תא הניסוי ובדקו את כיווץ ושלמותם. בלוח השמאלי, סיבי PL חיים (חץ כחול) ומתים. בלוח הימני, סיבי EDL חיים (חץ כחול) ומתים. (ה-ג) שלוש קבוצות של ניסויים בוצעו עם הסיבים המבודדים: (E) מדידות ריכוז Sarcoplasmic Ca2+ במהלך עוויתות (תוצאות באיור 3). (F) ניתוחים מורפומטריים (התוצאות מוצגות באיור 4). דוגמה זו מציגה סיב PL. (G) אימונופלואורסנציה עבור מחקרי ביטוי שרשרת כבדה של מיוזין (התוצאות מודגמות באיור 5). דוגמה זו מציגה סיב FDB מבודד. פסי קנה מידה = 5 מ"מ (B,C), 100 מיקרומטר (D,F,G). קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הפניות אנטומיות ופרוצדורה כללית לניתוח קבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. שורות, מלמעלה למטה, מציגות את השרירים על פי סדר הדיסקציה הטוב ביותר: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ו- PDQA. עמודות, משמאל לימין, מציגות את אבני הדרך במהלך הנתיחה. העמודה הראשונה מראה את השרירים או הגידים הדיסטליים שלהם חשופים כך שהדיסקציה יכולה להתחיל. לדוגמה, חיצים כחולים מצביעים על FDB ו-soleus in situ ועל הגידים הדיסטליים של ה-EDL. שתי העמודות הבאות ממחישות את הדיסקציה עצמה ואת השרירים החשופים לאחר הגיד הדיסטלי שנחתך/נחתך, כפי שמסומן, למשל, עם החץ הכחול בשורה EDL. מומלץ להסיר את ענף ה- FDB המופנה לספרה החמישית. העמודה הימנית ביותר מציגה את השרירים לאחר שהוסרו לחלוטין, כאשר הגידים הפרוקסימליים מכוונים לחלק העליון של התמונות. קווים כחולים ולא רציפים (עמודה ימנית קיצונית) ממחישים את החתכים האורכיים או האלכסוניים שיש לבצע בשרירי הסולאוס וה-EDL כדי להבטיח שהקולגנאז ייכנס לנפחם. מוטות קנה מידה = 5 מ"מ. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: Ca2+ transients שתועדו בסיבים שהתקבלו מקבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. (A) התקנה המשמשת לרכישת ארעי Ca2+ תחת תאורה מעומעמת. פאנל שמאלי: 1. PMT מחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (2). 3. מצלמה צמודה למיקרוסקופ. 4. ממריץ חשמלי המוצמד לתא הניסוי. 5. ניתן להשתמש במערכת המיקרומניפולציה כאשר מתוכננות בדיקות אלקטרופיזיולוגיה והזרקה כדי להשלים את רכישת Ca2+ transients. לוח אמצעי: תא הניסוי (הכנסה) עם התאים הטעונים מותקן על במת המיקרוסקופ ומואר באור כחול (450-490 ננומטר, חץ כחול) כדי לעורר את הצבע. במערך זה, פריטים 1 עד 5 מונחים מעל שולחן נגד רטט ובתוך כלוב של פאראדיי. פאנל ימני: לאחר אימות איכות ההתכווצות וטעינת הצבע באמצעות המצלמה (6), האור הנפלט מופנה ל- PMT, הגירוי החשמלי מתחיל, והאות מוזן לדיגיטציה (7) ולתוכנת הרכישה (8) כדי להקליט את Ca2+ חולף. ניתן לראות את הפונקציה המשולבת של אלמנטים אלה במהלך ניסוי חי בסרטון משלים S6. (B) Ca2+ טרנזיאנטים מייצגים, מכוילים של סיבי עכבר FDB, PDQA, PL, EDL, EHL ו-soleus. האותות הדומים, המהירים והצרים של FDB, PDQA, PL, EDL ו-EHL מאשרים כי MT-II כבר ידוע כי מקורם בסיבי IIX ו-IIB, שהם הנפוצים ביותר בשרירים אלה. לעומת זאת, ארעי הסולאוס איטי וקטן יותר, אופייני ל-MT-I, שתואר במקור בסיבי I ו-IIA. העקומה האדומה מעל אותות EDL וסוליאוס מדגימה כי שלב הדעיכה של MT-I ו- MT-II יכול להיות מצויד בפונקציית דעיכה דו-מעריכית. פסי כיול חלים על כל החלוניות. פס אנכי = 2.5 מיקרומטר של [Ca2+], פס אופקי = 10 אלפיות השנייה. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PMT = צינור מכפיל אור; MT-I = סוג מורפולוגיה I; MT-II = סוג מורפולוגיה II. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מדידות מורפומטריות של סיבים קצרים, בינוניים וארוכים שהתקבלו על-ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכבר. סיבים שלמים, בריאים ומייצגים מכל שריר מתוארים בלוחות העמודים השמאליים ביותר. התמונות נערכו רק כדי להפחית את רעשי הרקע ולשפר את הניגודיות, ללא מניפולציה ישירה של סיבי השריר. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (כל החלוניות). פרוטוקול המדידה, כמו גם המראה והאיכות של הסיבים הארוכים השלמים, ניתן לראות עוד יותר באיור משלים S1. העמודה האמצעית מציגה את התפלגות האורכים, מסודרים מהשריר שיצר את הסיבים הקצרים ביותר (FDB), לשריר עם הסיבים הארוכים ביותר (סולאוס). יש רצף של אורכים כך שיש חפיפה מסוימת בין השרירים, המשתרע על סך של ~ 5.5 מ"מ. התפלגות הקוטר מוצגת בחלוניות העמודות הימניות ביותר. רוב הסיבים הם בין 30 ל 60 מיקרומטר, עם הבדלים קטנים בין השרירים. ניתוחי בדיקה חוזרת (n = 78 סיבים, שווה ערך ל-9.85% מכלל המדגם של n = 792) של המדידות המורפומטריות הראו יכולת שחזור גבוהה מאוד (מקדם שונות ממוצע של 1.77%-רווח בר-סמך 95%, CI95%, 1.26-2.27%─מקדם מתאם ממוצע של 0.99% (CI95% 0.98-0.99)), והדגישו את האמינות הטובה של התוצאות. עקומות התפלגות גאוס נוספו עם תוכנת גרפים מורשית. איור משלים S2 מציג את תרשימי העמודות של הערכים הממוצעים של אורך וקוטר ואת המיזוגים של התפלגות האורך והקוטר של כל השרירים להשוואה קלה יותר. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL, = extensor hallucis longus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מבחני אימונופלואורסנציה עבור סוגי סיבים בתרחיף התא בשרירי FDB מנותקים. תמונות של שדות שונים מציגות סיבי FDB שלמים ומנותקים המודבקים לתחתית השקפים. (A) סיב אנטימיוזין II חיובי (פלואורסצנטיות ירוקה, חץ כחול בהיר אלכסוני) מנוגד בבירור לסיב שלילי (ראש חץ כחול בהיר), מה שמדגים את כוח ההבחנה של הבדיקה. נוכחותם של שני הסיבים בתמונה יכולה להיות מאושרת בגלל תיוג הגרעינים (פלואורסצנטיות כחולה). (B) שדה אחר מראה סיב אנטימיוזין II-חיובי נוסף. (C) זיהוי נכון של שרשרת מיוזין כבדה ברצועות A (פלואורסצנטיות ירוקה) על ידי הנוגדנים אושר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הרצועות השחורות הרוחביות הידועות ביותר לשמצה מתאימות לרצועות I, מועשרות באקטין ולכן צפויות שלא להיות מזוהות על ידי הנוגדנים. (D) המטוקסילין מסמן בסגול את הגרעינים ההיקפיים הטיפוסיים והשופעים, ואוזין מסמן את הסרקופלסמה של הסיב, ומראה תא שלם ובוגר. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A,B,D); 10 מיקרומטר (C). קיצור: FDB = flexor digitorum brevis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סיבי FDB ו-EDL סולאוס PDQA, PL ו-EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0.68±0.15 0.46±0.06*,† 0.66±0.12 <0.01
[כא2+] (מיקרומטר) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0.01
RT (ms) 0.95±0.10 1.26±0.20*,† 0.95±0.09 <0.01
שיפוע עלייה (F/ms) 5.97±1.41 3.12±0.79*,† 5.83±0.97 <0.01
HW (ms) 3.59±0.85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0.01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0.01
מדרון ריקבון (F/ms) -0.24±0.07 -0.10±0.03*,† -0.35±0.08* <0.01
τ1 (מטר/שניה) 1.86±0.37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0.05
τ2 (ms) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0.01
א1 (%) 48.14±7.27 25.94±8.98*,† 44.59±8.29 <0.01
א2 (%) 51.86±7.27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0.01
מורפולוגיה MT-II MT-I MT-II

טבלה 1: קינטיקה של Ca2+ transients בסיבים מנותקים אנזימטית המתקבלים מקבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. ערכי p מתאימים למבחן ניתוח השונות. *שונה באופן משמעותי מקבוצות FDB ו- EDL. †שונה באופן משמעותי מקבוצות PDQA, PL ו- EHL. קיצורים: F = פלואורסצנטיות; [Ca2+] = שיא ציטוסולי Ca2+ ריכוז; RT = זמן עלייה; HW = משך במחצית מקסימום; DT = זמן ריקבון; τ1 ו- τ2 = קבועי זמן של ריקבון; A1 ו- A2 = אמפליטודות של ריקבון; FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MT-I = סוג מורפולוגיה I; MT-II = סוג מורפולוגיה II.

סיבי FDB PDQA PL EDL EHL סולאוס p
n 370 142 80 70 87 43
אורך (מ"מ) 0.42±0.05* 2.20±0.26** 2.69±0.26† 3.51±0.53†† 3.83±0.44‡ 4.62±0.64 <0.01
קוטר (μm) 38.40±9.40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0.01

טבלה 2: מדידות מורפומטריות של סיבים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלות על ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכבר. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. ערכי p מתאימים למבחן ניתוח השונות. *שונה סטטיסטית מ- PDQA, PL, EDL, EHL ו- soleus. **שונה באופן משמעותי מ- PL, EDL, EHL ו- soleus. †שונה באופן משמעותי מ- EDL, EHL ו- soleus. ††שונה באופן משמעותי מ EHL ו soleus. ‡שונה משמעותית מסולאוס. שונה משמעותית מ- EHL. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

שריר/סיבים N n סה"כ סוג I + I/IIA (%) סה"כ סוג II (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

טבלה 3: סוגי סיבים בהקפאה ובתרחיף התא בשרירי FDB מנותקים של עכבר. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. N מתייחס למספר בעלי החיים, בעוד n מתייחס למספר הכולל של סיבים שנותחו בניסויים. שורת FDB מציגה נתונים של כל השריר כפי שנקבע בהקפאה, בעוד ששורת FDB מתאימה לסיבים מבודדים בתרחיף התא לאחר ניתוק השריר. העמודה "סה"כ סוג II" משקפת סיבים טהורים מסוג IIA, IIX ו- IIB. קיצור: FDB = flexor digitorum brevis.

שריר N n סוג I (%) סוג I/IIA (%) סוג IIA (%) סוג IIX (%) סוג IIB (%) סה"כ סוג II (%)
PDQA 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 37.85±5.66 35.66±9.36 94.52±3.90
EDL 4 826 0.00±0.00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89.56±8.33
EHL 5 618 24±0.76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
סולאוס 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

טבלה 4: סוגי סיבים בהקפאה של השרירים המעניקים סיבי עכבר בינוניים וארוכים. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. N מתייחס למספר בעלי החיים, בעוד n מתייחס למספר הכולל של סיבים שנותחו בניסויים. כל השורות מציגות נתונים של השריר כולו כפי שנקבע בהקפאה. עמודות מסוג I, IIA, IIX ו- IIB משקפות סיבים טהורים, ואילו עמודת I/IIA מתייחסת לסיבים היברידיים. העמודה "סה"כ סוג II" היא סיכום של העמודות מסוג IIA, IIX ו- IIB. קיצורים: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

קובץ משלים 1: מחקרי הבעת שרשרת כבדה של מיוזין בשרירים שלמים. הפרוטוקולים מציגים פרטים לקביעת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה על ידי אימונופלואורסנציה בקריוסקציה ועל ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד בהומוגנאטים של כל השרירים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S1: פרטים על המורפולוגיה של הסיבים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכבר. (A) סרגל כיול המיקרומטר של המיקרוסקופ הפתוח לקביעת קנה המידה בתוכנת ניתוח התמונה מוצג משמאל. הלוח הימני מראה כיצד הקוטר נמדד שוב ושוב כפי שמצוין על ידי הקווים הכחולים המאונכים לציר הארוך של הסיב (חיצים כחולים), בעוד שהאורך נמדד פעם אחת מקצה לקצה כפי שמודגם על ידי הקו הכחול לאורך הציר הראשי של הסיב. (B) מספר תמונות הורכבו בעריכה קלה כדי להדגים את המראה הארוך והבריא של סיבי PDQA, PL, EDL, EHL ו-SOLEUS (תוספות כחולות, ירוקות, צהובות, כתומות וורודות קטנות). התמונות שהורכבו נערכו עוד יותר כדי לתת לסיבים מראה טוב יותר (תמונות גדולות, שחורות ולבנות). (C) תמונות DIC של סיבי FDB, PDQA, PL ו-soleus המדגישות את אי-הסדירות הרגילה של קצהו ואת הפסיעות הרוחביות הידועות שלהם. ניתן לראות את מראה ה-DIC של סיבי ה-EDL וה-EHL הנותרים ב-Supplemental Video S3 וב-Supplemental Video S4. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB, flexor digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, extensor digitorum longus; EHL, extensor hallucis longus; DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: תרשימי עמודות והתפלגויות אורך וקוטר ממוזגים של הסיבים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של העכבר. (A) חלקות עמודות (ממוצע ± סטיות תקן) ו-(B) היסטוגרמות ממוזגות מאשרות את הפער באורכים אך את הדמיון בין הקטרים בין כל הקבוצות. *שונה באופן משמעותי מ- PDQA, PL, EDL, EHL ו- soleus. **שונה באופן משמעותי מ- PL, EDL, EHL ו- soleus. †שונה באופן משמעותי מ- EDL, EHL ו- soleus. ††שונה באופן משמעותי מ EHL ו soleus. ‡שונה משמעותית מסולאוס. שונה משמעותית מ- EHL. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: מחקרי אימונופלואורסנציה עבור הרכב סוג סיבים של קבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. קריוסקציות מייצגות עם תווית נוגדנים המשמשות לניתוחים מדגימות את האיכות הטובה והשלמות של הדגימות. יש דומיננטיות ברורה של סוג סיבים II בכל השרירים, למעט הסולאוס שבו כמות הסיבים מסוג I היא גדולה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: הפרדה אלקטרופורטית של איזופורמים MHC בקבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. (A) שני ג'לים מלאים מייצגים הפועלים בימים שונים עם דגימות שונות מדגימים את האיכות, הניקיון ויכולת השחזור של מרחק ההפרדה והנדידה של איזופורמים MHC כאשר הם מוכתמים בכחול קומאסי. למרות ששתי התמונות הללו נערכו מעט כדי לשפר את הניגודיות והבהירות עבור הקורא, הניתוחים בוצעו בג'לים לא ערוכים. (B) דוגמאות לניתוח הפסים עבור כל אחד מששת השרירים. לאחר בחירת החזר השקעה בנתיבי הג'ל, נוצר פרופיל עלילה והתאמה גאוסיאנית משמשת להערכת חלקם של איזופורמים MHC בקבוצה של שישה שרירים. הרכב MHC שנמצא היה: FDB: I 9.0 ± 5.0%, IIa + IIx 91.0 ± 5.0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25.9 ± 2.4%, IIb 74.1 ± 2.4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24.9 ± 2.2%, IIb 75.1 ± 2.2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22.0 ± 2.3%, IIb 78.0 ± 2.3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27.5 ± 1.0%, IIb 72.5 ± 1.0% (n = 3); soleus: I 35.8 ± 2.5%, IIa (+IIx + IIb כאשר קיים) 64.2 ± 2.5% (n = 4). מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. המלבן האפור מתחת לג'ל הימני ביותר ב- A מתייחס לסמן המשקל המולקולרי המציין את נדידת IIa ל~ 200 KDa. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MHC = שרשרת כבדה מיוזין; ROI = אזור עניין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S1: ה-peroneus longus הפגוע, הגלי והפרונוס (PL, משמאל) אינו מתכווץ בעת גירוי, בעוד שה-PL השלם (מימין) מתכווץ היטב, גם כאשר הוא רחוק יותר מהאלקטרודות. הגדלה פי 0.8. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.7 הרץ ו-50 וולט דרך שתי אלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S2: התכווצות סיבי peroneus longus. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S3: התכווצות extensor digitorum longus סיבים. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S4: התכווצות extensor hallucis longus סיבים. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S5. התכווצות סיבי סוליאוס. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו-50 וולט, דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S6: הקלטה חיה של Ca2+ ארעי מסיב extensor digitorum longus טעון Mag-Fluo-4, AM כמתואר בשלב 4.1.4. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשלים את המודלים הזמינים לחקר ביולוגיה של שרירי שלד בוגרים, כאן אנו מדגימים את הדיסוציאציה האנזימטית המוצלחת של מגוון שרירי עכבר עם סיבים קצרים, בינוניים וארוכים. סיבים אלה מאפשרים הדגמה של הכללה של קינטיקה MT-II של Ca2+ transients בשרירי השלד. יתר על כן, סוגי הסיבים בשרירים שלמים שלמים סווגו. בהתחשב בכך שה- FDB הוא השריר הנפוץ ביותר לניסויים פיזיולוגיים, הוערכו סוגי הסיבים הקיימים בתרחיף התא לאחר דיסוציאציה.

סוללה של סיבים שלמים קצרים, בינוניים וארוכים ללימודי ביולוגיה של שרירים
טכניקת הדיסקציה, משך הטיפול האנזימטי, סוג האנזים שבו נעשה שימוש והליך הטריטורציה הם שלבים קריטיים בפרוטוקול לקבלת סיבים אנזימטיים מנותקים שלמים. הדיסקציה חייבת להיעשות מהר ככל האפשר כדי להפחית את הזמן תחת היפוקסיה תוך הימנעות מתיחה מיותרת. הנקודה האחרונה רלוונטית במיוחד עבור הסוליאוס, אשר אסור להסיר על ידי משיכת קומפלקס gastrocnemius-soleus. יתר על כן, טיפול אנזימטי נרחב (~ 3 שעות)20,48 והליכי טריטורציה גרועים (למשל, ניסיון קשה ונמוך של החוקר) פוגעים בתאים, כפי שאושר אמפירית במספר מעבדות. Collagenase סוג 2 מומלץ על פני סוגים אחרים של collagenase. יש להימנע מהיווצרות בועות במהלך הטריטורציה ויש לתפעל את השרירים או הסיבים רק עם פיפטות זכוכית במקום קצות פיפטה מפלסטיק. השימוש בבקבוקוני זכוכית מועדף במהלך כל ההליך על פני בקבוקונים פלסטיים, חרוטיים, מכיוון שהראשון נותן יותר ראות, ניתן להציב כלפי מעלה על הסטריאוסקופ לתצפית עליונה על השריר כאשר בתמיסות, לתת יותר מקום לטריטציה של השרירים ארוכים ומגושמים יותר מה- FDB, ועמידים בפני שריטות הנגרמות על ידי פיפטות פסטר זכוכית. מכיוון שגיל, משקל ומצב מטבולי (למשל, השמנת יתר בריאה לעומת השמנת יתר עתירת שומן) משפיעים על יעילות השיטה, מספר פרמטרים עשויים להזדקק לאופטימיזציה בעבודה עם בעלי חיים מחוץ לטווח המשמש בכתב יד זה. חשוב לציין כי חשיפה קלה של שריר לאנזימים מסוימים כמו אלה המשמשים כאן והליך דיסוציאציה נכון אינם משפיעים תפקודית על הסיבים, כפי שעולה מעדויות שנאספו במשך עשרות שנים על ידי קבוצות רבות, שחלקן סוכמו לפני מספר שנים49. זה נתמך עוד יותר על ידי העובדה כי השיא [Ca2+] נמדד עם צבעי Ca2+ מהירים במהלך עווית שהושגה בצרורות מנותחים ידנית וסיבים אנזימטיים מנותקים של עכברים יכול להיחשב דומה (נסקר ב 47).

למרות שישנם מודלים אחרים למחקרים בביולוגיה של שרירים, כגון צינוריות C2C12, קווי תאי מיובלסט אנושיים נורמליים ומוטנטים, או סיבים שמקורםבתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) 31,39,50,51,52,53, הם אינם בשלים ואינם נדונים כאן. סיבים חדירתיים או עוריים הם גם אינפורמטיביים, מאופיינים היטב מודלים54,55, אבל הם לא שלמים. המודל של סיבים מבודדים ידנית מציע מספר יתרונות כפי שהוצג במקום אחר20 אך הוא בעל יעילות נמוכה ודורש הכשרה גבוהה. עובדות אלה מדגישות כי מודל העניין כאן - סיבים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית - מציע את האפשרות להשיג סיבי שרירי שלד שלמים, שופעים ובוגרים מסוגים שונים. עם זאת, מגבלה אחת של המודל היא שהמחסור בגידים מגביל את ההערכה הישירה של תכונות ההתכווצות בסיבים המבודדים.

בהתחשב בכך שאורך הסיבים אינו זהה לאורך השרירים14,42 וכי הסיבים הם יחידת הניסוי, רלוונטי יותר לסווג את אורך הסיבים, לא את אורך השרירים. בהתחשב בתוצאות שלנו ובהשלכות הניסוייות האפשריות שלהם, ניתן לסווג את סיבי ה-FDB כקצרים (<1 מ"מ); PDQA ו- PL כביניים (1 עד 3 מ"מ); ו-EDL, EHL ו-soleus באורך (>3 מ"מ). סיבים קצרים הם הקלים והנפוצים ביותר (~ 400-500 סיבים לעכבר) והם מתאימים לניסויים במיקרוסקופ פלואורסצנטי שבהם החיבור של הסיב לתא התחתון הוא המפתח, או כאשר יש להימנע מחפצים תנועתיים (למשל, Ca2+ transients). סיבים ארוכים הם הקשים ביותר להשגה, בעלי הרינדור הנמוך ביותר, והם טובים יותר לביטוי חלבונים באמצעות טכניקות הפרדה או מחקרי ביולוגיה מולקולרית של תא יחיד. ניתן להשיג סיבי ביניים בכמות טובה (~50 סיבים לעכבר) לאחר אימון מתון והם מתאימים לגישות ניסיוניות רבות, כפי שהוכח למשל בניסויי Ca2+ transients. מתוך הכרה בכך ש-FDB, EDL ו-soleus שימשו בעבר, זוהי העבודה הראשונה שבודדה בהצלחה סיבים משרירי PDQA, PL ו-EHL, ובכך הגדילה את זמינותם של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים. יתר על כן, השגת סיבים משרירים שונים מבטיחה קבלת מידע רב יותר מאותה חיה, הפחתת השונות הניסויית, הגדלת הכוח הסטטיסטי והאיתנות הביולוגית של המסקנות, והפחתת מספר בעלי החיים המשמשים בניסויים.

הכללה של קינטיקה של Ca2+ transients
כאשר ניתחנו את הקינטיקה של מעברי Ca2+ בסיבי שרירי שלד בוגרים של יונקים, הראינו בעבר כי סיבים מסוג I ו- IIA חולקים את מה שמכונה סוג מורפולוגיה I (MT-I), בעוד סיבים IIX ו- IIB חולקים את המורפולוגיה MT-II. בדרך כלל, לאותות MT-II יש RT של פחות מ-1.2 אלפיות השנייה, DT של פחות מ-25 אלפיות השנייה, A1 גבוה מ-30%, [Ca2+] מעל 15 מיקרומטר, וניתן למצוא אותם בקלות בסיבי FDB ו-EDL33,47. לאחר השוואת התוצאות של הרומן Ca2+ transients של PDQA, PL, ו- EHL עם אלה שנמצאו כאן ואלה שפורסמו בעבר עבור FDB ו- EDL, זה פשוט להסיק כי הם כולם MT-II גם כן. תצפית מעניינת נוספת היא שהגדלת הזמינות של שרירים חדשים המועשרים בסיבים מסוג IIX ו- IIB כמודלים להשגת סיבים מנותקים מאפשרת לאשר כי הקינטיקה של מעברי Ca2+ יכולה להיות כללית מסוג IIX ולסיבי IIB יש MT-II ללא קשר למקורם (כלומר, פלקסורים (FDB), מרחיבים (EDL ו- EHL), או peronei (PDQA ו- PL)). זה מחזק את הרעיון של תוכנית תאית גנטית מבוססת או פרופיל של מנגנון ECC, אשר דומה למדי בכל הסיבים מאותו סוג, וכי הבדלים במנגנון המולקולרי (כלומר, איזופורמים וכמות חלבונים) העומדים בבסיס יצירת Ca2+ transients להסביר את ההבדלים במורפולוגיות המדווחות בין סיבים33. לבסוף, השלכה מעשית היא כי על ידי הקלטה עם Mag-Fluo-4 Ca2+ חולף של סיב, ניתן לדעת באופן אמין את סוגו.

ביטוי MHC בשרירים ובסיבים מבודדים: השלכות על סוגי סיבים המשמשים בניסויים פיזיולוגיים
הכרת סוג הסיבים מגדילה את האמינות של מחקר שרירים. לדוגמה, בעכברי נוקאאוט של חלבון כלשהו המתבטא באופן דיפרנציאלי לפי סוגי סיבים, שימוש בסיבי FDB ללא כל הקלדה עלול להוביל לתוצאות מטעות. הנתונים שלנו מאשרים כי FDB הוא שריר מעורב עם דומיננטיות של סיבים מסוג IIX, בהתאם למאמרים קודמים 25,31,56. חשוב מכך, הייתה קונקורדנציה גבוהה בין שיעור סוגי הסיבים הקיימים בשריר כולו לבין זה שהתקבל לאחר דיסוציאציה. מכיוון שמידע זה הוא חדשני ואינו נדון בדרך כלל במאמרים המשתמשים בסיבי FDB, ניתן לשער כי, במקרה, תוצאות רבות שהושגו בסיבי FDB מנותקים עשויות באמת לשקף מידע מעורב של ~20-25% המגיע מסיבים מסוג I ו- 75-80% מסוג II. מחקרים עתידיים המשתמשים בשריר FDB צריכים להציג נתונים ואת הדיון המתאים להם, ביחס לסוגי סיבים.

מכיוון שסולאוס מועשר מאוד בסיבים מסוג I, IIA ו- I/IIA 57,58,59, אלה הם הסיבים הנמצאים בתרחיף לאחר דיסוציאציה 33. EDL, שריר ידוע נוסף, כמעט נטול סיבים מסוג I 57,58,59, ולכן מייצר רק סיבים מהירים לאחר דיסוציאציה33. על פי אותו היגיון ועל פי תוצאות ההקלדה המראות העשרה של סיבים מסוג II בשלושת השרירים החדשים, הנתמכים עוד יותר על ידי העובדה שהסיבים המעטים מסוג I הנמצאים בשרירי הפרוני של עכבר הם מרכזיים60 ולא צפויים להגיע אליהם במהלך דיסוציאציה קלה, אנו משערים כי ההסתברות לשימוש בסיב IIX או IIB מהיר בניסוי עם סיבים מנותקים של PDQA, PL, או EHL יכול להיות גבוה כמו 80-90%. נראה שזה נכון על פי נתוני Ca2+ transients שבהם לא נמצאו אותות MT-I. בהתחשב בגודלם, סיבים אלה מציעים את היתרון בכך שהם מתאימים להקלדה לאחר סיום ניסוי פונקציונלי. יתר על כן, הספציפיות של BTS עבור MHC II מסייעת להבחין בין סוגי סיבים תוך הסרת חפצי תנועה. לבסוף, בעוד ששיטת הקלדת סיבים זו הייתה מייגעת יותר מזו שתוארה לאחרונה61,62, היא לא השפיעה על תוצאות העבודה הנוכחית.

מסקנות
הפרטים המתודולוגיים המוצגים עשויים לעודד שימוש במגוון סיבי שריר מנותקים אנזימטית בחקר ביולוגיה של שרירים. הרבגוניות של המודל נתמכת על ידי האפשרות לקבל סיבים בטווח גדול של אורכים וסוגים והשימוש בהם על פני מספר יישומים ניסיוניים. מלבד FDB, EDL ו-Soleus שהדיסוציאציה שלהם דווחה לפני שנים, הדגמנו את ההיתכנות של קבלת סיבים בינוניים וארוכים משרירים אחרים כגון PDQA, PL ו-EHL. בהתחשב בקלות שבה ניתן לבצע את הדיסקציה ובמספר הסיבים שניתן להשיג, כמו גם ההומוגניות והגודל של הסיבים, אנו מציעים PL כמודל שגרתי ומתאים למחקרי שרירי שלד בוגרים. זה נתמך על ידי הממצאים שלנו כי קינטיקה של Ca2+ transients בשרירי השלד ניתן להכליל ללא קשר למקור שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מביעים את תודתם לפרופסור רובינסון רמירז מ-UdeA על העזרה עם בעלי חיים וכמה תמונות ולקרולינה פלאסיוס על התמיכה הטכנית. יוהאן פינדה מקיקה עזר לנו להתקין את מצלמות הצבע והפלורסצנטיות. שיואן נגו, מאוניברסיטת קווינסלנד, הגיה באדיבות את כתב היד. מחקר זה מומן על ידי CODI-UdeA (2020-34909 מה-22 בפברואר 2021, ו-2021-40170 מה-31 במרץ 2022, SIU), ומשרד התכנון UdeA (E01708-K ו-ES03180101), מדיין, קולומביה, ל-JCC. המממנים לא השתתפו באיסוף וניתוח נתונים, בכתיבת כתבי יד או בהגשתם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260 (2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14 (2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939 (2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898 (2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976 (2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118 (2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199 (2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807 (2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074 (2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961 (2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669 (2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796 (2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654 (2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126 (2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075 (2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Tags

ביולוגיה גיליון 202 שרירי השלד סיבי שריר סוגי סיבים Ca2+ צימוד עירור-כיווץ אימונופלואורסנציה שרשרת כבדה מיוזין
סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter