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ओस्टियोसारकोमा मॉडल चूहों में पारंपरिक चीनी चिकित्सा के काढ़े सूत्र के लिए नलिका रणनीति

Published: June 7, 2024 doi: 10.3791/66177
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

Summary

प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में ओस्टियोसारकोमा माउस मॉडल में यिकी जिएड काढ़े के साथ काढ़ा सूत्र और नलिका तकनीक की एक विस्तृत मानकीकरण प्रक्रिया प्रदान करता है। यह पशु संरक्षण का वर्णन करता है और अनुसंधान डेटा की विश्वसनीयता में सुधार करता है, चिकित्सीय प्रभावकारिता और विवो में काढ़े सूत्रों के आणविक तंत्र की जांच के लिए प्रभावी रणनीति प्रदान करता है।

Abstract

काढ़ा सूत्र पारंपरिक चीनी चिकित्सा में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला खुराक रूप है और ट्रांस-ओरल प्रशासन द्वारा हजारों वर्षों से नैदानिक अभ्यास में लागू किया जाता है, जो रोगियों के विशिष्ट सिंड्रोम के आधार पर त्वरित प्रभाव, आसान अवशोषण और व्यक्तिगत उपचार की विशेषता है। काढ़े सूत्र की गुणवत्ता पारंपरिक चीनी चिकित्सा की नैदानिक प्रभावकारिता के लिए सीधे जिम्मेदार है; इसलिए, व्यक्तिपरक कारकों के कारण काढ़े की गुणवत्ता में अंतर से बचने के लिए काढ़े सूत्र की मानकीकरण प्रक्रिया महत्वपूर्ण है। इस बीच, नैदानिक प्रयोगों को करने की सीमाओं के कारण, चूहों जैसे मानव रोगों वाले छोटे जानवरों को अक्सर चिकित्सा अनुसंधान में चिकित्सीय प्रभावकारिता और विभिन्न हस्तक्षेपों के व्यापक तंत्र का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें पारंपरिक चीनी चिकित्सा के लिए काढ़ा सूत्र भी शामिल है। नतीजतन, एक महत्वपूर्ण ट्रांस-ओरल प्रशासन विधि के रूप में, कुशल नलिका तकनीक संभावित अन्नप्रणाली क्षति और दवा रिसाव से बचने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो प्रत्येक मॉडल जानवर को प्रशासित की जा रही दवा की समान मात्रा सुनिश्चित करेगी, जिससे सटीक प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त होंगे। इसके अलावा, काढ़ा सूत्र तैयार करने और कुशल नलिका रणनीति की मानकीकृत विधि पशु कल्याण की रक्षा और उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करने के लिए आवश्यक है। यहां, हमने एक उदाहरण के रूप में ओस्टियोसारकोमा माउस मॉडल में यिकी जिएडू काढ़े के साथ काढ़ा सूत्र और गैवेज तकनीक की एक विस्तृत मानकीकरण प्रक्रिया की सूचना दी। प्रभावकारिता का मूल्यांकन ट्यूमर की मात्रा द्वारा किया गया था। यह प्रोटोकॉल पशु संरक्षण को अधिकतम करेगा और अनुसंधान डेटा की विश्वसनीयता में सुधार करेगा, इसलिए भविष्य में चिकित्सीय प्रभावकारिता और विवो में पारंपरिक चीनी चिकित्सा के लिए काढ़े सूत्र के आणविक तंत्र की जांच के लिए प्रभावी रणनीति प्रदान करेगा।

Introduction

काढ़ा सूत्र पारंपरिक चीनी दवा और तरलऔषधीय दवाओं 1,2 का सबसे अधिक इस्तेमाल किया खुराक रूप है. पारंपरिक चीनी चिकित्सा के काढ़े के फार्मूले को भिगोने के बाद जड़ी-बूटियों को पानी में काढ़ा करके संसाधित किया जाता है, इसके बाद ड्रेग्स को त्यागने के लिए छानने के बाद।

क्योंकि काढ़ा सूत्र नैदानिक आवश्यकताओं के आधार पर individualized किया जा सकता है, विशेष रूप से पारंपरिक चीनी चिकित्सा में सबूत आधारित उपचार की विशेषताओं के साथ लाइन में, ट्रांस मौखिक प्रशासन के माध्यम से इस खुराक फार्म विशिष्ट और अपूरणीय लाभ 3,4 के साथ साल के हजारों के लिए नैदानिक अभ्यास में लागू किया गया है. काढ़े सूत्र की गुणवत्ता सीधे नैदानिक प्रभावकारिता से संबंधित है। इसलिए, काढ़ा सूत्र मानकीकृत काढ़े विधियों के सिद्धांतों के आधार पर तैयार किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सक्रिय तत्व अधिकतम रूप से निकाले और संरक्षित हैं3. इस बीच, काढ़े-तैयार दवाएं नैदानिक अभ्यास में उपयोग की जाने वाली कच्ची चीनी जड़ी-बूटियों का मुख्य रूप हैं; निर्धारित काढ़े-तैयार दवाओं के गुणवत्ता मानकों और उत्पादन विधियों को चीनी फार्माकोपिया2 के प्रावधानों का पालन करना चाहिए। इसके अलावा, निर्धारित काढ़े-तैयार दवाओंको गर्म करके एक विशेष दवा बर्तन में काढ़े जाने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए ठंडे पीने के पानी में भिगोया जाना चाहिए। अध्ययनों से पता चला है कि सक्रिय अवयवों के अधिकांश दो बार के लिए decocting द्वारा निकाला जा सकता है, और चिकित्सा संस्थानों में पारंपरिक चीनी दवाओं के काढ़े कमरे के प्रशासन के लिए अभ्यास संहिता भी काढ़े दो बार 4,6,7 किया जाना निर्धारित करता है. यदि विशेष चीनी जड़ी बूटी, जैसे कि कठोर बनावट या टॉनिक के साथ, निर्धारित हैं, तो काढ़े का समय बढ़ाने की सिफारिश की जाती है। काढ़े के बर्तन और भंडारण कंटेनर जो सीधे काढ़े के सूत्र के संपर्क में आते हैं, उस कंटेनर से शुरू होते हैं जिसमें निर्धारित काढ़े-तैयार दवाएं भिगोई जाती हैं, रासायनिक रूप से स्थिर होनी चाहिए और पुलाव, चीनी मिट्टी की चीज़ें, कांच और स्टेनलेस स्टील जैसे ढक्कन होने चाहिए। हालांकि, एल्यूमीनियम और साधारण प्लास्टिक उत्पादों का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, जबकि लोहे और अन्य संक्षारक बर्तनों को संभव रासायनिक प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए निषिद्ध किया जाना चाहिए, जो चिकित्सीय प्रभावकारिता को कम करेगा और यहां तक किहानिकारक प्रभाव 4,6,7 उत्पन्न करेगा।

नैदानिक प्रयोगों प्रदर्शन की सीमाओं के कारण, चूहों जैसे मानव रोगों असर छोटे जानवरों, अक्सर चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है चिकित्सीय प्रभावकारिता और पारंपरिक चीनी चिकित्सा 8,9 के काढ़े सूत्र सहित विभिन्न हस्तक्षेपों के व्यापक तंत्र का पता लगाने के लिए; हालांकि, मनुष्यों के विपरीत, काढ़े के सूत्रों को हर दिन तैयार किया जाना चाहिए, एक साथ मिलाया जाना चाहिए, और नैदानिक अभ्यास में दिन में 2x ताजा प्रशासित किया जाना चाहिए। पशु स्वेच्छा से आवश्यक खुराक के साथ समय पर अपनी दवाएं लेने में असमर्थ हैं, और पारंपरिक चीनी चिकित्सा से संबंधित अधिकांश पशु प्रयोग वर्तमान में काढ़े के सूत्रों के नली-आधारित मौखिक प्रशासन हैं। विवो पशु प्रयोगों में के लिए इस्तेमाल काढ़ा सूत्रों अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए, aliquoted, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत औरबस 3,4,10 का उपयोग करने से पहले पिघलना. इसके अलावा, घटिया पशु स्थिरीकरण और नलिका सुई हेरफेर अनावश्यक चोटों और नकारात्मक भावनाओं के जोखिम को बढ़ाते हैं। इसलिए, ट्रांस-ओरल ड्रग डिलीवरी की एक महत्वपूर्ण विधि के रूप में, कुशल नलिका तकनीक विशेष रूप से संभव एसोफेजियल चोट और दवा रिसाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकार यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक मॉडल जानवर सटीक प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए निर्धारित हर्बल दवा की समान मात्रा प्राप्त करता है। यहां, हम पारंपरिक चीनी चिकित्सा के काढ़े सूत्र के लिए एक गैवेज प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल एक नमूने के रूप में यिकी जिएड काढ़े का उपयोग करके ओस्टियोसारकोमा मॉडल चूहों में विस्तृत नलिका तकनीक का वर्णन करता है। इस प्रयोग में चार सप्ताह के पुरुष एथिमिक चूहों (बीएएलबी / सी न्यूड) का उपयोग किया गया था और शंघाई यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन में प्रयोगशाला पशु केंद्र के एसपीएफ़-ग्रेड प्रजनन कक्ष में रखा गया था। सभी पशु प्रयोगों को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के शंघाई विश्वविद्यालय के पशु प्रबंधन और समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, प्रयोगशाला जानवरों के लिए आचार संहिता (पशु नैतिकता अनुमोदन संख्या: PZSHUTCM2304060007) का अनुपालन किया गया था, और प्रयोगशाला जानवरों से संबंधित अंतरराष्ट्रीय आवश्यकताओं के अनुसार सख्त रूप से आयोजित किया गया था।

1. सामग्री

  1. निम्नलिखित सामग्री प्राप्त करें: चीनी जड़ी बूटी (जिनसेंग 42 ग्राम, हेड्योटिस डिफ्यूसा 52.5 ग्राम, कांटेदार खोपड़ी जड़ी बूटी 31.5 ग्राम), 1 एमएल सिरिंज, और 12 जी / 55 मिमी कोहनी गैवेज सुई (चित्रा 1)।

2. खुराक निर्धारण

  1. दैनिक खुराक की गणना निम्नानुसार करें: 60 किलो के मानक शरीर के वजन वाले वयस्कों के लिए दैनिक खुराक जिनसेंग 12 ग्राम, हेड्योटिस डिफ्यूसा 15 ग्राम, और कांटेदार खोपड़ी जड़ी बूटी 9 ग्राम है, जिसमें कुल 36 ग्राम काढ़ा-तैयार दवा है, यानी 0.6 ग्राम काढ़ा-तैयार दवाएं / बराबर खुराक के लिए 12 बार, कम खुराक के लिए 6 बार, और 60 किलो के मानक शरीर के वजन वाले वयस्कों के बीच उच्च खुराक के लिए 24 बार और शरीर की सतह क्षेत्र11 के अनुसार 25 ग्राम के मानक शरीर के वजन वाले चूहों के साथ-साथ हमारे प्रारंभिक डेटा का जिक्र करते हुए, वर्तमान अध्ययन में चूहों के लिए यिकी जिएडु काढ़े के 20 गुना खुराक अनुपात का उपयोग करें, इसलिए, चूहों के लिए खुराक 12 ग्राम काढ़े-तैयार दवाएं /
  2. समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक माउस के लिए खुराक की गणना:
    माउस के लिए खुराक (स्टैंड बॉडी वेट) = वयस्क के लिए खुराक (स्टैंड बॉडी वेट) x 20 (नामित समकक्ष खुराक अनुपात)।
    प्रत्येक माउस की दैनिक खुराक 0.3 ग्राम [(12 ग्राम काढ़ा-तैयार दवाएं / 1000 ग्राम शरीर का वजन) x 25 ग्राम शरीर का वजन] 200 माइक्रोन में 1.5 ग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता के साथ है।
  3. 28 दिनों के लिए नलिका प्रशासन के साथ यिकी जिएडु काढ़े समूह में चूहों (एन = 7) के लिए कुल काढ़े-तैयार दवाओं की गणना 58.8 ग्राम करें। एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए इसे 39.2 एमएल तक ध्यान केंद्रित करें।
  4. काढ़े और नलिका चरणों के दौरान संभावित दवा के नुकसान को ध्यान में रखते हुए, और गणना की सुविधा के लिए, कुल 126 ग्राम (जिनसेंग 42 ग्राम, हेड्योटिस डिफ्यूसा 52.5 ग्राम, कांटेदार खोपड़ी जड़ी बूटी 31.5 ग्राम) काढ़ा-तैयार दवा तैयार करें, 84 एमएल की अंतिम मात्रा में ध्यान केंद्रित करें।

3. सेल स्रोत और संस्कृति

  1. एटीसीसी सेल बैंक से मानव-व्युत्पन्न 143 बी ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं की खरीद करें।
  2. बीज 1 x 106 143B कोशिकाओं में 10% एफबीएस, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त 10 सेमी सेल कल्चर डिश में।
  3. संस्कृति 143B कोशिकाओं को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर जब तक कोशिकाओं को 80% -90% संगम नहीं किया जाता है।

4. मॉडलिंग के तरीके

  1. 80% संगम सुसंस्कृत 143 बी कोशिकाओं को इकट्ठा करें, 10% सीरम युक्त एमईएम माध्यम के 6 एमएल में फिर से निलंबित करें और 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के साथ सेल निलंबन बनाने के लिए 1: 1 के वॉल्यूम अनुपात में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जेल के साथ मिलाएं।
  2. प्रत्येक एथिमिक माउस के बाएं टिबिया में सेल निलंबन के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें ताकि सीटू ज़ेनोग्राफ्ट ओस्टियोसारकोमा माउस मॉडल स्थापित किया जा सके, जैसा कि हमारे पिछले प्रकाशन12में वर्णित है। संक्षेप में चरण इस प्रकार हैं।
    1. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 2x धोएं। 3 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के 1.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें। 10% सीरम युक्त एमईएम मीडिया के 6 एमएल जोड़ें। एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं को लीजिए.
    2. सेल गिनती प्लेट के कक्ष में सेल निलंबन के 20 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
    3. एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 8.5 मिलीग्राम/एमएल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और उन्हें बर्फ पर रखें।
    4. चूहों को 2% आइसोफ्लुरेन और 98% ऑक्सीजन (ऑक्सीजन प्रवाह दर, 2 एल/मिनट) के संपर्क में लाकर एनेस्थेटाइज करें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम की एक छोटी राशि लागू करें।
    5. पूरी प्रक्रिया को एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में करें। ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माउस धीरे पैर को छूकर गहरी संज्ञाहरण के तहत है; यदि माउस में अभी भी प्रतिक्रियाएं हैं, जैसे कि चिकोटी या झटका। लंबे समय तक प्रतीक्षा करें यदि माउस में अभी भी प्रतिक्रियाएं हैं, जैसे कि चिकोटी या झटका, जब तक कि ये प्रतिक्रियाएं गायब न हो जाएं।
    6. माउस को लापरवाह स्थिति में रखें। अंगूठे और तर्जनी का उपयोग कर माउस के टखने पकड़ो और betadine और 70% इथेनॉल झाड़ू के तीन बारी दौर के साथ टिबिया के इंजेक्शन साइट कीटाणुरहित.
    7. सुई को 1 एमएल सिरिंज में संलग्न करें और टिबिया की धुरी के समानांतर इंजेक्शन साइट की ओर सुई टिप को इंगित करें। Percutaneously टिबिया के बाहर का अंत की ओर टिबिया मंच के माध्यम से एक छेद ड्रिल करने के लिए सुई डालें.
    8. पहले एक microvolume सिरिंज में बर्फ पर रखा जा रहा है osteosarcoma सेल निलंबन लोड और osteosarcoma सेल भरी हुई microvolume सिरिंज के साथ टिबिया में 1 एमएल सिरिंज की जगह. धीरे-धीरे प्रत्येक एथिमिक माउस के टिबिया में लगभग 10 माइक्रोन (1 x 107 कोशिकाओं/एमएल) ओस्टियोसारकोमा सेल निलंबन को इंजेक्ट करें।
    9. इंजेक्शन साइट से माइक्रोवॉल्यूम सिरिंज निकालें, और लगभग 30 एस के लिए कपास झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट दबाएं। माउस को वापस एक साफ पिंजरे में रखें और 10 मिन के लिए इसकी वसूली का निरीक्षण करें।

5. नलिका के लिए पारंपरिक चीनी दवा काढ़ा सूत्र की तैयारी (चित्रा 2)

  1. चरण 2 के अनुसार खुराक की गणना करें।
  2. काढ़े के लिए सभी औषधीय जड़ी बूटियों भिगोएँ, महंगी जड़ी बूटी जिनसेंग को छोड़कर, एक स्तर के साथ पीने के पानी में 3 सेमी दवा की सतह से अधिक सेमी, 30 मिनट के लिए, और फिर काढ़ा प्रदर्शन 2x के रूप में नीचे वर्णित है.
  3. एक मजबूत आग पर उबलने के लिए गर्म करके पहला काढ़ा करें, और फिर हल्की आग पर 15-25 मिनट के लिए गर्म करें। हल्की आग आमतौर पर 80 डिग्री सेल्सियस से 100 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान के साथ कम शक्ति वाली गर्मी को संदर्भित करती है, जबकि मजबूत आग आमतौर पर 200 डिग्री सेल्सियस से 300 डिग्री सेल्सियस तक की उच्च शक्ति वाली गर्मी को संदर्भित करती है।
  4. काढ़े के तरल को एक कंटेनर में डालें।
  5. पीने के पानी में औषधीय जड़ी बूटियों को गर्म करके दूसरा काढ़ा करें, दवा की सतह को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ, एक मजबूत आग पर उबालने के लिए, और फिर हल्की आग पर 15-25 मिनट के लिए गर्म करें।
  6. काढ़े के तरल को उसी कंटेनर में डालें जैसा कि चरण 5.4 में है।
  7. दवा की सतह से 3 सेमी अधिक पीने के पानी के साथ अलग से 42 ग्राम जिनसेंग को भिगोएँ और काटें, क्योंकि यह महंगा है।
  8. 60 मिनट के लिए एक मजबूत आग पर गर्म करके लथपथ जिनसेंग का पहला काढ़ा करें।
    काढ़े के तरल को उसी कंटेनर में डालें जैसा कि चरण 5.4 में है।
  9. 40 मिनट के लिए एक हल्के आग पर गर्म करके, दवा की सतह को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ पीने के पानी में जिनसेंग का दूसरा काढ़ा करें। काढ़े के तरल को उसी कंटेनर में डालें जैसा कि चरण 5.4 में है।
    नोट: काढ़े के लिए उपयोग किए जाने वाले कंटेनर रासायनिक रूप से स्थिर होने चाहिए, जैसे कि पुलाव (नैदानिक अभ्यास में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला), चीनी मिट्टी की चीज़ें, कांच और स्टेनलेस स्टील औषधीय पदार्थों के साथ संभावित रासायनिक प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए। विभिन्न चरणों से प्राप्त सभी काढ़े तरल को एक ही कंटेनर में रखा जाना चाहिए।
  10. रबर बैंड के साथ एक मापने वाले कप के मुंह पर तय धुंध की तीन परतों का उपयोग करके काढ़े तरल को मिलाएं और फ़िल्टर करें।
  11. एक बर्तन में एक मजबूत आग पर फ़िल्टर्ड काढ़े को उबालें, फिर हल्की आग में बदलें और लक्ष्य एकाग्रता तक पहुंचने तक हल्की आग रखें (1.5 ग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के साथ 84 एमएल की अंतिम मात्रा)।
  12. 1 सप्ताह के लिए इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन के लिए आवश्यक खुराक के अनुसार केंद्रित काढ़े के 21 एमएल एलिकोट तैयार करें, और एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।

6. एक gavage डिवाइस का उपयोग करके चूहों में नलिका प्रशासन

  1. माउस पिंजरे या अन्य खुरदरी सतह की सतह पर माउस रखें.
  2. दाहिने हाथ के अंगूठे और तर्जनी के साथ माउस की पूंछ को पकड़ें। फिर, बाएं हाथ के अंगूठे, तर्जनी और मध्यमा उंगली से माउस की गर्दन को पकड़ें।
  3. माउस के सिर, गर्दन और शरीर को एक सीधी रेखा में बनाने के लिए बाएं हाथ की अन्य दो उंगलियों के साथ माउस की पूंछ को पकड़ें।
    नोट: पूरी लोभी प्रक्रिया के दौरान माउस को आराम से रखना सुनिश्चित करें। यदि माउस स्थानांतरित करने के लिए संघर्ष करता रहता है, तो लोभी प्रक्रिया माउस आराम है जब तक प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  4. दाहिने हाथ में नलिका उपकरण पकड़ो और 20 ग्राम शरीर के वजन (100 माइक्रोन काढ़ा सूत्र / माउस के 10 ग्राम शरीर वजन) के साथ एक माउस के लिए काढ़ा सूत्र के 200 माइक्रोन लोड.
  5. कोने से मुंह में नलिका सुई डालें और माउस के ऊपरी जबड़े के खिलाफ जीभ धक्का.
  6. माउस शरीर को एक ही दिशा में रखें और धीरे से नलीका के साथ पेट की ओर नलिका सुई धक्का जब तक नलिका सुई के बारे में 10 मिमी बाहर छोड़ दिया है.
    नोट: वहाँ एक खोखला लग रहा है जब नलिका सुई घुटकी में प्रवेश करती है. माउस में डाला नलिका सुई की लंबाई उरोस्थि के शीर्ष करने के लिए मापा जाना चाहिए. नलिका सुई की कुल लंबाई 60 मिमी (चित्रा 3) है, इसलिए, काढ़ा सूत्र माउस के पेट में इंजेक्शन से पहले माउस के शरीर में नलिका सुई के बारे में 50 मिमी डाला जाना चाहिए.
  7. काढ़े के फार्मूले को चूहे के पेट में इंजेक्ट करें। प्रतिरोध या मुंह के कोने से निकलने वाले तरल को पूरा करने का मतलब है कि नलिका सुई का गलत स्थान, जिससे बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, काढ़ा सूत्र मोटी होने पर इंजेक्शन की गति को धीमा किया जाना चाहिए।
  8. माउस को छोड़ दें और 10 मिनट के लिए उनका निरीक्षण करें। नलिका सफल है अगर कोई साँस लेने की असामान्यता मनाया जाता है और पिंजरे (चित्रा 4) में माउस वापसी.

7. उपचार का कोर्स

  1. Yiqi Jiedu काढ़े की चिकित्सीय प्रभावकारिता का पता लगाने के लिए, एक नियंत्रण समूह और एक Yiqi Jiedu काढ़ा समूह स्थापित करें। नियंत्रण समूह में चूहों के लिए, शारीरिक खारा प्रशासन, 28 दिनों के लिए दिन में एक बार. Yiqi Jiedu काढ़े समूह में चूहों के लिए, 28 दिनों के लिए दिन में एक बार Yiqi Jiedu काढ़ा का प्रशासन करें।

8. प्रतिकूल प्रतिक्रिया

  1. पिंजरे में वापस रखे जाने के बाद चूहों की स्थिति का बारीकी से निरीक्षण करें, जिसमें वजन घटाने और पेट में प्रवेश करने के लिए भोजन की अक्षमता के कारण मानसिक स्थिति में कमी शामिल है।
  2. चूहे भोजन के कारण श्वासनली की रुकावट के कारण सांस लेने में कठिनाई और सांस की तकलीफ का अनुभव करेंगे और श्वासनली को साफ करने के प्रयास में खांसी करेंगे। यदि नलिका के दौरान इनमें से कोई भी लक्षण देखा जाता है, तो तुरंत नलिका को रोकें और चूहों को इच्छामृत्यु दें।

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Representative Results

विवो में ओस्टियोसारकोमा के विकास पर यिकी जिएडू काढ़े का निरोधात्मक प्रभाव एक इंट्रा-टिबियल ज़ेनोग्राफ्ट ओस्टियोसारकोमा माउस मॉडल में निर्धारित किया गया था, जिसे 143 बी ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को एथिमिक चूहों के टिबिया में इंजेक्ट करके तैयार किया गया था। Yiqi Jiedu काढ़े को Yiqi Jiedu काढ़े समूह के चूहों को 143B इंजेक्शन के दूसरे दिन से शुरू होने वाले 28 दिनों के लिए नलिका द्वारा प्रशासित किया गया था। शारीरिक खारा नियंत्रण समूह में चूहों को दिया गया था. सभी चूहों को 28 दिनों के बाद इच्छामृत्यु दी गई थी। परिणामों से पता चला कि यिकी जिएडु काढ़े समूह में ट्यूमर की मात्रा नियंत्रण समूह (चित्रा 5) की तुलना में काफी कम हो गई थी।

Figure 1
चित्र 1: काढ़ा उपभोग्य। काढ़े के लिए तैयार दवा के होते हैं (ए) जिनसेंग, (बी) Hedyotis diffusa, (सी) कांटेदार खोपड़ी जड़ी बूटी, (डी) स्नातक मापने कप, (ई) रबर बैंड, (एफ) धुंध, (जी) रबर बैंड के साथ मापने कप के मुंह पर धुंध की तीन परतों को ठीक करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पारंपरिक चीनी चिकित्सा के लिए काढ़ा सूत्र की तैयारी। (ए) जिनसेंग को छोड़कर काढ़े के लिए तैयार दवाएं 30 मिनट के लिए भिगोई जा रही हैं। (बी) जिनसेंग को 30 मिनट के लिए अलग से भिगोया जा रहा है। (सी) जिनसेंग को अलग से काढ़ा किया जा रहा है। (डी) पारंपरिक चीनी चिकित्सा के फ़िल्टरिंग काढ़े सूत्र। (ई) पारंपरिक चीनी चिकित्सा के केंद्रित काढ़े सूत्र का भंडारण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नलिका उपभोग्य सामग्रियों। मूल सुई (बाएं पैनल) के साथ नियमित रूप से 1 एमएल सिरिंज, और मूल सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज को एक गैवेज डिवाइस (दाएं पैनल) सेट करने के लिए नंबर 12/55 मिमी कोहनी गैस्ट्रिक छिड़काव सुई द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस में नलिका प्रशासन की प्रक्रिया. (ए) पिंजरे की सतह पर माउस. (बी) माउस पूंछ एक हाथ से पकड़ा जा रहा है। (सी-डी) माउस एक हाथ से तय किया जा रहा है। (ई) सुई माउस मुंह से डाला जा रहा है. (च) नलिका प्रशासन का अंत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ओस्टियोसारकोमा माउस मॉडल में काढ़े का निरोधात्मक प्रभाव। (ए) ओस्टियोसारकोमा के नमूने नियंत्रण समूह और यिकी जिएड काढ़े हस्तक्षेप समूह से एकत्र किए जा रहे हैं। त्रुटि सलाखों मानक विचलन (एन = 7) (बी) नियंत्रण (Ctrl) समूह और Yiqi Jiedu काढ़ा हस्तक्षेप समूह के बीच ट्यूमर मात्रा के अयुग्मित टी परीक्षण के लिए खड़े हैं। 28 दिनों के लिए Yiqi Jiedu काढ़ा हस्तक्षेप ट्यूमर की मात्रा (p<0.05) को काफी रोकता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (n = 7) के लिए खड़ी हैं। (सी)Yiqi Jiedu काढ़ा gavage समूह और प्रयोगात्मक अवधि के दौरान नियंत्रण समूह में चूहों के शरीर का वजन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पारंपरिक चीनी चिकित्सा में निर्धारित जड़ी बूटियों की नैदानिक प्रभावकारिता काफी हद तक प्रशासित खुराक और खुराक के रूप में जुड़ी हुई है; इसलिए, नैदानिक अभ्यास में एक मानकीकृत काढ़ा रणनीति और एक कुशल प्रशासन प्रक्रिया की स्थापना आवश्यक है, साथ ही प्रयोगात्मक परिणामों की विश्वसनीयता में सुधार भी आवश्यक है।

इस अध्ययन में, हमने पहले पारंपरिक चीनी चिकित्सा के नैदानिक अभ्यास में उपयोग की जाने वाली चीनी जड़ी बूटियों के मानकीकृत काढ़े के लिए एक विस्तृत रणनीति प्रदान की, जो वैज्ञानिक रूप से काढ़े की दवाओं के लिए लोगों के मार्गदर्शन की सुविधा प्रदान करती है, व्यावहारिक रूप से काढ़े सूत्र की गुणवत्ता और हर्बल दवाओं की नैदानिक प्रभावकारिता में भी सुधार करती है; इसलिए, एक बार मानकीकरण प्राप्त हो जाने के बाद, यह नैदानिक अभ्यास में हर्बल दवा प्रभावकारिता की सटीकता और स्थिरता में सुधार करेगा।

नलिका रणनीति व्यापक रूप से पूर्व नैदानिक अध्ययन में एक मौखिक सेवन विधि के रूप में लागू किया गया है और इस तरह के प्रशासन में आसानी, सटीक खुराक नियंत्रण, और दवा प्रशासन13 के नैदानिक मार्ग की नकल करने की क्षमता के रूप में कुछ फायदे, प्रदान करता है, जो चूहों, चूहों, और खरगोशों, सहित विभिन्न प्रयोगात्मक जानवरों, पर लागू होता है. हालांकि, जानवरों को संघर्ष करना होगा यदि वे संज्ञाहरण के बिना गलत स्थिति में स्थिर हैं, जो शोधकर्ताओं के स्वास्थ्य को खतरा हो सकता है और प्रयोगों की विश्वसनीयता को कम कर सकता है। इसलिए, इन संभावनाओं को कम करने और गलती से घुटकी में प्रवेश करने या घुटकी क्षति के कारण काढ़े से बचने के लिए एक मानकीकृत नलिका विधि की स्थापना महत्वपूर्ण है, जो बदले में पशु मृत्यु और प्रयोगात्मक विफलता का कारण बनती है।

यहां, हमने ओस्टियोसारकोमा मॉडल चूहों में काढ़ा सूत्र देने के लिए नलिका मार्ग चुना, क्योंकि इसने हमें प्रयोग के दौरान खुराक और वारंट लगातार दवा वितरण को ठीक से मापने की अनुमति दी। काढ़ा सूत्र तैयार करने के लिए, हमने पहले माउस के लिए काढ़े-तैयार दवाओं की मात्रा की गणना 60 किलो के शरीर के वजन वाले वयस्कों के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा के 20 गुना के अनुपात के आधार पर की; भिगोया हुआ, और उबलने के लिए गर्म करके 2x काढ़ा; फ़िल्टर केंद्रित है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य में काढ़े को संग्रहीत करता है। नलिका प्रशासन प्रदर्शन करने के लिए, एक नलिका डिवाइस में केंद्रित काढ़े सूत्र के 200 माइक्रोन लोड करें, मुंह में नलिका सुई डालें, धीरे पेट की ओर नलिका सुई धक्का और माउस के पेट में काढ़े सूत्र इंजेक्षन. हमारे निष्कर्षों में से एक समूह में मनाया ट्यूमर के विकास का महत्वपूर्ण निषेध है जो नलिका के माध्यम से यिकी जिएडु काढ़े का काढ़ा सूत्र प्राप्त करता है। हमने नियंत्रण समूह की तुलना में यिकी जिएड काढ़े समूह में ट्यूमर की मात्रा में स्पष्ट कमी देखी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि नलिका रणनीति प्रभावी ढंग से लक्ष्य साइट के लिए काढ़े सूत्र के सक्रिय घटकों बचाता है, शक्तिशाली विरोधी ट्यूमर प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अलावा, हम प्रयोगात्मक अवधि के दौरान चूहों की सामान्य स्थिति और शरीर के वजन की निगरानी के द्वारा नलिका रणनीति की सुरक्षा प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन किया. हमें Yiqi Jiedu काढ़ा गैवेज समूह और नियंत्रण समूह के बीच शरीर के वजन में परिवर्तन या विषाक्तता के संकेतों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला, यह दर्शाता है कि काढ़े सूत्र का नलिवाला प्रशासन अच्छी तरह से सहन किया जाता है और स्पष्ट प्रतिकूल प्रभाव पैदा नहीं करता है।

हालांकि नलिका रणनीति प्रयोगात्मक जानवरों के लिए काढ़ा सूत्र देने में प्रभावी साबित हुई, यह संभावित प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं और इस प्रशासन विधि के साथ जुड़े कुछ सीमाओं का एहसास करने के लिए महत्वपूर्ण है. भोजन के कारण श्वासनली रुकावट से बचने के लिए, बारीकी से नलिका के दौरान और बाद में माउस की स्थिति का निरीक्षण करें, जैसे कि सांस लेने में कठिनाई, सांस की तकलीफ और खांसी। एक बार उनमें से कोई भी दिखाई देने के बाद, तुरंत नलिका को रोक दें और क्षैतिज हार्ड डेस्कटॉप पर छाती को संकुचित करें; इसके अलावा, किसी भी गंभीर स्थिति के लिए तत्काल पशु चिकित्सा सहायता आवश्यक है। इसके अलावा, हमें निम्नलिखित सीमाओं पर पूरा ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, नलिका जानवरों में तनाव पैदा कर सकता है, संभावित रूप से उनके समग्र शरीर विज्ञान और उपचार की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। हालांकि, हम एक छोटे से खिला सुई का उपयोग कर और नलिका प्रक्रिया के दौरान धीरे चूहों को संभालने के द्वारा तनाव को कम करने के लिए कार्रवाई की. इसके अलावा, नलिका केवल एक व्यक्ति है जो विशेष रूप से प्रशिक्षित किया गया है और यह सुनिश्चित करने के लिए योग्य है कि एक मानकीकृत तकनीक जानवरों14 के लिए संभावित नुकसान से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा किया जा सकता है. दूसरे, सटीक तंत्र जिसके द्वारा काढ़े सूत्र के सक्रिय घटक अपने एंटी-ट्यूमर प्रभाव डालते हैं, अस्पष्ट रहता है। यह संभव है कि नलिका रणनीति हर्बल यौगिकों के फार्माकोकाइनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स को बदल सकती है, संभावित रूप से उनकी जैव उपलब्धता और चिकित्सीय प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकती है। भविष्य के अध्ययन नलिका के माध्यम से वितरित काढ़े सूत्र के विरोधी ट्यूमर प्रभाव अंतर्निहित सटीक तंत्र को स्पष्ट करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए. इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि लंबी अवधि के नलिका के दौरान isoflurane संज्ञाहरण आवेदन काढ़े के अधूरे घूस और अकुशल नाव तकनीक15 के कारण पशु मृत्यु को कम कर देता है. इस बीच, काढ़े में खाना पकाने के तेल जोड़ने से गैवेज से जुड़े पशु तनाव16 कम हो जाता है।

अंत में, हमने चीनी जड़ी बूटियों की मानकीकृत काढ़ा प्रक्रिया और चूहों के लिए कुशल नलिका रणनीति प्रदान की। ये प्रयास न केवल प्रयोगात्मक चूहों की संभावित एसोफेजियल चोटों और मृत्यु से बचते हैं, बल्कि यह सुनिश्चित करने के लिए दवा अतिप्रवाह से भी बचते हैं कि प्रत्येक प्रयोगात्मक जानवर हर्बल दवाओं की समान मात्रा का प्रशासन करता है, इसलिए, प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता और स्थिरता में सुधार करता है, चिकित्सीय प्रभाव भी। हमारा अध्ययन एक ऑस्टियोसारकोमा माउस मॉडल में पारंपरिक चीनी दवा काढ़े सूत्र के प्रशासन के लिए नलिका रणनीति की प्रभावकारिता और सुरक्षा को दर्शाता है। ये परिणाम ओस्टियोसारकोमा के उपचार में इस वितरण पद्धति की क्षमता को उजागर करते हैं और पारंपरिक चीनी चिकित्सा प्रशासन की गैवेज रणनीति के अनुकूलन में आगे के शोध की नींव रखते हैं। इसके अतिरिक्त, भविष्य के अध्ययनों को काढ़े सूत्र में सक्रिय घटकों के सटीक कार्रवाई तंत्र की जांच करनी चाहिए और ओस्टियोसारकोमा रोगियों में चिकित्सीय परिणामों को बढ़ाने के लिए अन्य उपचार पद्धतियों के साथ संभावित सहक्रियात्मक प्रभावों का पता लगाना चाहिए। इसलिए, ये निष्कर्ष इस प्रशासन पद्धति के संभावित लाभों और सीमाओं पर प्रकाश डालते हैं और ओस्टियोसारकोमा उपचार में इसके आवेदन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

वर्तमान कार्य (1) राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (81973877 और 82174408), (2) चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2020YFE0201600), (3) शंघाई शीर्ष प्राथमिकता अनुसंधान केंद्र निर्माण परियोजना (2022ZZ01009), (4) अस्पताल टीसीएम तैयारी के औद्योगिक परिवर्तन के शंघाई सहयोगी नवाचार केंद्र, और (5) पारंपरिक चीनी चिकित्सा के शंघाई विश्वविद्यालय (2021LK047) के बजट के भीतर अनुसंधान परियोजनाओं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
143B cell line ATCC CRL-8303 osteosarcoma cell line
Anesthesia machine Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd R500IP The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
BALB/c athymic mice Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. Male Animal
Barbed skullcap herb Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. 20230606 Decoction-ready medicines 
Basement Membrane Matrix Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd 356234, BD, Matrigel re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 430790, Corning Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm) RWD Life Science Co., Ltd. C21014-12 Component of gastric perfusion device
Gauze Haishi Hainuo Group Co., Ltd. LC45 Decoction filter
Ginseng Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. 20220704-2 Decoction-ready medicines 
Hedyotis diffusa Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. 2023071107 Decoction-ready medicines 
isoflurane Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd VETEASY Anesthesia mice
Micro-volume syringe Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd 0-50 μL Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline Beyotime Biotechnology ST447 wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd. XPJ Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL ) Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd. SBM0040 Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells

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References

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Zhou, C., Sun, X., Chang, J., Tong,… More

Zhou, C., Sun, X., Chang, J., Tong, J., Zhao, P., Guo, S., Yang, Y. Gavage Strategy for Decoction Formula of Traditional Chinese Medicine in Osteosarcoma Model Mice. J. Vis. Exp. (208), e66177, doi:10.3791/66177 (2024).

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