Summary
实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是一种多发性硬化症 （MS） 动物模型，与人类疾病具有强大的体液自身免疫反应。在这里，我们报告了一种简单而灵活的ELISA方案，用于量化EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。
Abstract
实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是一种疾病模型，在组织病理学和分子水平上概括了自身免疫性疾病多发性硬化症 （MS）。EAE 是通过 皮下注射 短髓鞘肽和特定佐剂对实验动物进行免疫接种来诱导的，以增强免疫反应。与人类对应物一样，EAE小鼠会出现脱髓鞘病变，免疫细胞浸润到中枢神经系统（CNS），神经胶质细胞激活和神经元损伤。一致的证据也支持 B 细胞功能障碍在 MS 和 EAE 病因中的机制作用。B细胞可以作为抗原呈递细胞，也是促炎细胞因子和自身抗体的主要来源。在 EAE 中，产生针对用于诱发疾病的髓鞘肽的抗体。这种自身抗体已被证明可以介导髓鞘丢失或致病性 T 细胞再激活到中枢神经系统中。本文介绍了一种基于 ELISA 的有效方案，用于量化用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 35-55 （MOG35-55） 肽免疫的 C57BL/6J 小鼠血清中的自身抗体。所提出的方法是一种强有力的工具，可用于研究自身免疫性脱髓鞘背景下异常体液反应的特异性和程度。
Introduction
多发性硬化症 （MS） 是一种中枢神经系统 （CNS） 的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞局灶性浸润到脑实质、包裹轴突的髓鞘破裂、神经胶质细胞活化和神经元丢失1。除了致病性 T 细胞的公认作用外，多条证据还强调了 B 细胞参与介导针对中枢神经系统的自身免疫反应。B 细胞在 MS 脑中发生克隆扩增，并且在脱髓鞘病变中检测到针对髓鞘成分的抗体 2,3。最近有记录表明，外周 B 细胞在疾病发作时的选择性激活，表明该免疫细胞区室在疾病起始中也具有假定的作用4。B 细胞耗竭疗法（如抗 CD20 单克隆抗体）的成功进一步证实了异常 B 细胞功能与自身免疫性脱髓鞘之间的机制联系 5,6。从分子的角度来看，B 细胞可以通过自身抗原呈递、促炎细胞因子分泌和自身反应性抗体产生来导致疾病。
已经开发了多种动物模型来概括复杂 MS 表型的特定特征。其中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是 体内 应用最广泛的范式，依赖于实验动物使用源自髓鞘蛋白的短肽进行免疫，如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）和髓鞘碱性蛋白（MBP）7。EAE 免疫动物发展出脱髓鞘病理学，在许多方面类似于 MS，包括对脑炎肽8 的强大体液反应。出于这个原因，EAE 研究在解剖 B 细胞和自身抗体在疾病背景下的功能方面发挥了重要作用。例如，研究表明，从 MS 患者中分离出的 MOG 特异性抗体可以加重 EAE 模型9 的临床病程。 值得注意的是，人 MOG 中 42 位的脯氨酸残基被证明对于确定自身抗体致病性至关重要10。最近，已发现 MOG 特异性自身抗体不仅通过介导髓鞘丢失来促进疾病，而且还通过促进中枢神经系统11 内自身反应性 T 细胞的再激活。
考虑到抗体反应在中枢神经系统自身免疫中的重要性，本文提出了一种基于 ELISA 的方案，以有效测量用 MOG35-55 肽免疫的 C57BL/6J 小鼠 EAE 中自身反应性抗体的血清水平。在方案的第一部分，将描述 通过 心内穿刺收集血清的方法。随后，将详细说明设置 ELISA 测定和获取数据的程序。最后，将讨论数据分析和解释。
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Protocol
所有涉及小鼠的程序均按照东卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的实验指南进行。本研究使用8-10周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见材料表）。EAE 是在先前发表的报告 12,13,14 之后诱导的。
1. 血清采集
- 在通过MOG35-55免疫诱导EAE后，在所需的时间点（遵循机构批准的方案）通过CO2窒息或异氟烷过量对实验小鼠实施安乐死。
注：小鼠总数和血清收集的时间点可以根据具体实验而变化。 - 在通过脚趾或尾巴捏确认没有生命体征后，将小鼠置于解剖托盘的背部卧位，并用别针或胶带将四肢固定到位。将鼠标身体对准 LED 光源（参见 材料表）以照亮动物的胸部。
- 用70%乙醇喷洒小鼠皮毛，并使用解剖剪刀从骨盆到剑突沿腹部切开3-4厘米的中线切口，注意避免任何器官和主要血管（图1A-C）。为了方便该过程，请使用镊子抓住剑突上方的皮肤。
- 横向切开横膈膜，然后使用弹簧剪刀在两个侧缘前切肋骨，在到达中线的胸骨之前停下来（图1D）。折叠在小鼠头上创建的肋骨瓣，露出心脏（图1E）。
注意：应避免切割胸骨，因为这会损害靠近骨骼的主要胸动脉并减少可以收集的血液量。 - 将连接到1mL注射器的25G针插入左心室，并通过轻轻拉回柱塞来收集血液（图1F）。为了便于穿刺针刺穿，轻轻地将心脏支撑在一副镊子上。
注意：如果血液没有立即进入注射器，则应缓慢旋转针头，并应测试不同的角度。但是，在第一次尝试时应努力正确放置针头，以避免在心脏上产生不必要的孔，使血液渗出。 - 将血液转移到无菌 1.5 mL 管中，并在室温下凝结 30 分钟。通过在4°C下以2000×g离心20分钟除去凝块。 收集代表血清分数的上清液，并将一次性等分试样储存到-80°C的低温管中，以备将来检测。
2. ELISA检测
- 将冻干的 MOG35-55 肽（参见 材料表）重悬于水中，以获得 10 mg/mL 储备液。在开始实验之前，在包被缓冲液中将储备液稀释至 10 μg/mL（参见 材料表），并将 100 μL/孔的最终溶液移液到 96 孔板中。用粘性薄膜密封板以避免蒸发，并将板在4°C下孵育过夜。
注意：每个样品至少应计算 2 个孔，空白对照也应包括 2 个额外的孔。 - 同时，用溶解在包被缓冲液中的100μL/孔牛血清白蛋白（BSA）以10μg/ mL浓度包被相同数量的孔包被。这些额外的孔将用作背景控制。
注意：建议在对照孔中涂覆 BSA，因为涂层和封闭缓冲液具有不同的成分。请注意，其他产脑肽（如PLP139-151或MBP84-104）可用作BSA的无关抗原。 - 第二天，用 200 μL/孔的磷酸盐缓冲盐水洗涤板 3 次，盐水补充有 0.05% 吐温 20 （PBS-T）。随后，在PBS（不含吐温20）中加入100μL/孔由3%BSA制成的封闭溶液，并将密封的板在37°C下在杂交炉中孵育1小时。
- 用 200 μL/孔的 PBS-T 洗涤板 3 次。在封闭溶液中以 1：100 稀释每个血清样品，并将 100 μL/孔添加到 MOG35-55 和 BSA 包被孔中。将相同体积的封闭溶液添加到指定为空白的孔中。将密封的板在室温下孵育2小时，并不断摇动（250rpm）。
- 用 200 μL/孔的 PBS-T 洗涤板 3 次。在由 0.2% BSA 制成的 PBS-T 溶液中稀释 HRP 偶联的二抗（1：2000，参见 材料表），并向所有孔中加入 100 μL/孔。在室温下将密封的板孵育1小时，并不断摇动（250rpm）。
- 用 200 μL/孔的 PBS-T 洗涤板 3 次。向所有孔中加入 100 μL/孔的 3,3'，5,5' 四甲基联苯胺 （TMB） 底物（参见 材料表），并在黑暗中孵育 1-5 分钟，监测蓝色的发展。
- 通过加入 100 μL/孔的终止溶液（参见 材料表）终止反应，并使用设置为 450 nm 波长的读板器测量每个孔中的光密度 （OD）。
注意：TMB 底物应在室温下平衡 30-60 分钟，然后再将其添加到孔中。
- 通过加入 100 μL/孔的终止溶液（参见 材料表）终止反应，并使用设置为 450 nm 波长的读板器测量每个孔中的光密度 （OD）。
3. 数据分析
- 使用从板中读取的 OD 值填充 Excel 电子表格。平均每个样品从重复孔（MOG35-55 和 BSA 涂层）获得的 OD 值。
- 对于每个样品，从 MOG35-55 涂层孔的平均值中减去 BSA 涂层孔的平均值。所得的背景校正值将与不同血清样本中抗 MOG35-55 抗体的浓度成正比。
注意：空白孔应产生 0 左右的校正值。 - 应用非参数统计检验（如 Mann-Whitney U 检验）来比较两个实验条件之间的平均 OD 值。每个条件至少包括 3 个独立样本。
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Representative Results
为了证明本 ELISA 测定的稳健性，在免疫 （dpi） 后 20 天，在 C57BL/6J 雌性小鼠队列中分离的血清样品中测试了该方法，在经过验证的 EAE 诱导方案 12,13,14 之后，在完全弗氏佐剂 （CFA） 中。动物在第 0 天和第 2 天还接受了 400 ng 百日咳毒素。来自模拟免疫动物的血清样本，含有所有物质，但没有肽，作为阴性对照。所有 EAE 小鼠在 11-14 dpi 之间出现疾病的最初迹象，并在 20 dpi 时达到 0-6 分的平均得分为 2.6 ± 0.6（标准误差，SE）（0，无迹象;1，尾音降低;2，轻度单脑麻痹或截瘫;3，严重截瘫;4，截瘫;5，四肢麻痹;和 6，垂死或死亡）12。正如预期的那样，与对照样品相比，EAE样品的OD值明显更高（图2）。这些数据证实了在疾病高峰期存在针对 MOG 肽的强大 IgG 免疫球蛋白反应。
图 1：心脏穿刺程序。 （A-E） 成年小鼠进入心脏的开胸手术的代表性图像。（F） 将针头插入小鼠心脏左心室的正确程序的代表性图像。每个面板中都标明了相关的解剖结构，以方便解剖。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：MOG肽自身抗体ELISA。 使用报告的 ELISA 方案在免疫后 20 天 （dpi） 在 EAE 和模拟免疫小鼠中测试抗 MOG35-55 IgG 免疫球蛋白的血清水平。与对照组相比，在 EAE 样品中检测到的 OD 值始终较高。数据以均值± SE 表示（N = 3 每组）。采用单尾Mann-Whitney U检验评估组间差异，*P ≤ 0.05。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里，报道了一种简单有效的基于 ELISA 的方案，以准确量化 MS 病理学相关动物模型中的体液反应。该方法最近被用于描述 ataxin-1 蛋白在控制 MOG35-55/C57BL6J EAE 范式12 中自身抗体水平方面的新作用。在这方面，应该考虑许多因素，以便使用这种方法获得一致且具有生物学意义的结果。
首先，收集高质量的血清样本并避免溶血至关重要。在严重溶血的标本中，从红细胞中释放的血红蛋白和其他细胞内成分会干扰 ELISA 测定中的抗原-抗体反应和相对颜色测量。为防止溶血，最好在采血过程中避免注射器中的高负压，因为这会导致红细胞破裂。
其次，稀释血清样品以获得吸光度曲线线性部分内的 OD 值非常重要。我们推荐的稀释因子 （1：100） 是根据我们的小鼠品系中诱导的 EAE 病理学实体进行校准的。考虑到这种 体内 模型的内在异质性水平，强烈建议进行初步滴定实验，以确定所测试的特定 EAE 病理学的理想稀释因子。同样，可以调整与TMB底物的孵育时间，以避免显色信号的饱和，并将OD值保持在0-2范围内。
第三，在本协议中获得的校正OD值与不同实验条件之间的自身抗体血清滴度的半定量分析或沿疾病进展的动力学研究兼容。如果需要对自身抗体水平进行绝对定量，则必须在 ELISA 设计中实施校准曲线。针对MOG肽的多种抗体是市售的，可以作为可靠的标准品来计算EAE小鼠血清中MOG特异性抗体的浓度。为了捕获不同幅度的效应，建议为校准抗体包括各种稀释度（浓度范围从 pg/mL 到 μg/mL）。
最后，该协议非常灵活，可以很容易地适应不同的研究需求。例如，可以改变包被的致脑肽，以评估其他 EAE 范式中的自身抗体反应。此外，可以使用不同的二抗来测量不同免疫球蛋白类别的水平。为此，该协议成功证明 ataxin-1 控制 IgG 和 IgM 类别的 MOG 肽特异性抗体12。最后，可以设想它可用于检测多发性硬化症患者血液中的自身抗体。然而，EAE 和 MS 疾病之间存在很大差异。前者是通过用强佐 剂增强针对 明确定义的自身抗原的免疫反应来人工诱导的，而后者是自发产生的，目前还没有确定明确的自身抗原。最近的证据表明分子模拟可能与病毒蛋白有关15。因此，在将该动物模型中收集的观察结果直接转化为人类疾病时，应始终考虑注意事项。
总之，本方案代表了商业ELISA试剂盒的一种简单方便的替代方案，并且可以与其他方法（如基于细胞的测定（CBA））有效地结合，以精确估计自身免疫性脱髓鞘背景下自身抗体的释放。
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Disclosures
提交人声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院 （R03NS131908） 和国防部通过多发性硬化症研究计划的支持，奖励编号为 W81XWH-22-1-0517。意见、解释、结论和建议是作者的观点、解释、结论和建议，并不一定得到国防部的认可。这项研究也得到了东卡罗来纳大学启动基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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