Summary
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.
Abstract
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo de doença que recapitula o distúrbio autoimune esclerose múltipla (EM) em níveis histopatológicos e moleculares. A EAE é induzida pela imunização de animais experimentais por meio de injeção subcutânea de peptídeos curtos de mielina juntamente com adjuvantes específicos para aumentar a resposta imune. Como a contraparte humana, os camundongos EAE desenvolvem lesões desmielinizantes, infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC), ativação da glia e lesão neuronal. Um corpo consistente de evidências também apóia um papel mecanicista para a disfunção das células B na etiologia da EM e da EAE. As células B podem servir como células apresentadoras de antígenos, bem como uma fonte primária de citocinas pró-inflamatórias e autoanticorpos. Na EAE, os anticorpos são gerados contra os peptídeos de mielina que foram empregados para induzir a doença. Foi demonstrado que esses autoanticorpos mediam a perda de mielina ou a reativação de células T patogênicas no SNC. Este artigo descreve um protocolo eficiente baseado em ELISA para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos C57BL/6J imunizados com o peptídeo glicoproteína 35-55 de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55). O método proposto serve como uma ferramenta poderosa para investigar a especificidade e a magnitude da resposta humoral aberrante no contexto da desmielinização autoimune.
Introduction
A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração focal de células imunes no parênquima cerebral, quebra das bainhas de mielina que envolvem os axônios, ativação da glia e perda neuronal1. Além do papel bem estabelecido das células T patogênicas, várias linhas de evidência destacaram o envolvimento das células B na mediação da resposta autoimune contra o SNC. As células B sofrem expansão clonal no cérebro da EM e anticorpos contra componentes da mielina foram detectados em lesões desmielinizadas 2,3. A ativação seletiva de células B periféricas no início da doença foi recentemente documentada, sugerindo um papel putativo para esse compartimento de células imunes também no início da doença4. O sucesso das terapias de depleção de células B, como anticorpos monoclonais anti-CD20, corrobora ainda mais a conexão mecanicista entre o funcionamento aberrante das células B e a desmielinização autoimune 5,6. Do ponto de vista molecular, as células B podem contribuir para a doença por meio da apresentação de autoantígenos, secreção de citocinas pró-inflamatórias e produção de anticorpos autorreativos.
Vários modelos animais foram desenvolvidos para recapitular características específicas do fenótipo complexo da EM. Dentre eles, a encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o paradigma in vivo mais amplamente utilizado e depende da imunização de animais experimentais com peptídeos curtos derivados de proteínas de mielina, como a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) e a proteína básica de mielina (MBP)7. Animais imunizados com EAE desenvolvem uma patologia desmielinizante que se assemelha à SM em muitos aspectos, incluindo uma resposta humoral robusta contra o peptídeo encefalitogênico8. Por esse motivo, os estudos de EAE têm sido fundamentais para dissecar a função das células B e autoanticorpos no contexto da doença. Por exemplo, foi demonstrado que anticorpos específicos para MOG isolados de pacientes com EM podem agravar o curso clínico em modelos de EAE9. Notavelmente, o resíduo de prolina na posição 42 em MOG humano mostrou-se crítico para determinar a patogenicidade do autoanticorpo10. Mais recentemente, descobriu-se que os autoanticorpos específicos para MOG promovem a doença não apenas mediando a perda de mielina, mas também aumentando a reativação de células T autorreativas no SNC11.
Considerando a importância das respostas de anticorpos na autoimunidade do SNC, este artigo apresenta um protocolo baseado em ELISA para medir eficientemente os níveis séricos de anticorpos autorreativos em camundongos C57BL/6J EAE imunizados com o peptídeo MOG35-55. Na primeira parte do protocolo, será descrito o método de coleta de soro por punção intracardíaca. Posteriormente, serão detalhados os procedimentos para configurar o ensaio ELISA e adquirir os dados. Por fim, será discutida a análise e interpretação dos dados.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes experimentais aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da East Carolina University (IACUC). Camundongos fêmeas C57BL/6J do tipo selvagem entre 8 e 10 semanas de idade foram usados neste estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). A EAE foi induzida após relatórios publicados anteriormente 12,13,14.
1. Coleta de soro
- Eutanasiar o camundongo experimental por asfixia com CO2 ou overdose de isoflurano no ponto de tempo necessário (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) após induzir EAE via imunização MOG35-55.
NOTA: O número total de camundongos e os pontos de tempo para a coleta de soro podem variar de acordo com o experimento específico. - Depois que a ausência de sinais vitais for confirmada pelo pinçamento do dedo do pé ou da cauda, coloque o camundongo em uma posição de decúbito dorsal em uma bandeja de dissecção e fixe os membros na posição com alfinetes ou fita adesiva. Oriente o corpo do rato para a fonte de luz LED (consulte a Tabela de Materiais) para iluminar o tórax do animal.
- Pulverize o pelo do camundongo com etanol a 70% e faça uma incisão na linha média de 3-4 cm ao longo do abdômen, da pelve ao xifóide, usando a tesoura dissectorial, tomando cuidado para evitar quaisquer órgãos e vasos importantes (Figura 1A-C). Para facilitar o procedimento, use a pinça para agarrar a pele sobre o processo xifóide.
- Corte o diafragma lateralmente e, em seguida, corte a caixa torácica anteriormente em ambas as bordas laterais usando a tesoura de mola, parando antes de atingir o esterno na linha média (Figura 1D). Dobre a aba da costela que foi criada sobre a cabeça do mouse para expor o coração (Figura 1E).
NOTA: Cortar o esterno deve ser evitado, pois isso danificará as principais artérias torácicas adjacentes ao osso e reduzirá o volume de sangue que pode ser coletado. - Insira uma agulha de 25 G conectada a uma seringa de 1 mL no ventrículo esquerdo e colete o sangue puxando suavemente o êmbolo para trás (Figura 1F). Para facilitar a punção da agulha, segure suavemente o coração contra uma pinça.
NOTA: Se o sangue não aparecer imediatamente na seringa, a agulha deve ser girada lentamente e um ângulo diferente deve ser testado. No entanto, esforços devem ser feitos para colocar a agulha corretamente na primeira tentativa para evitar a criação de orifícios desnecessários no coração por onde o sangue pode vazar. - Transfira o sangue para um tubo estéril de 1,5 mL e deixe-o coagular por 30 minutos em temperatura ambiente. Remover o coágulo por centrifugação a 2000 × g durante 20 min a 4 °C. Colete o sobrenadante, que representa a fração sérica, e armazene alíquotas de uso único em tubos criogênicos a -80 °C para testes futuros.
2. Ensaio ELISA
- Ressuspenda o peptídeo MOG35-55 liofilizado (consulte a Tabela de Materiais) em água para obter um estoque de 10 mg / mL. Antes de iniciar o experimento, dilua o estoque para 10 μg / mL em tampão de revestimento (consulte a Tabela de Materiais) e pipete 100 μL / poço da solução final em uma placa de 96 poços. Selar a placa com uma película adesiva para evitar a evaporação e incubar a placa durante a noite a 4 °C.
NOTA: Pelo menos 2 poços devem ser calculados para cada amostra e 2 poços adicionais também devem ser incluídos para um controle em branco. - Paralelamente, revestir o mesmo número de alvéolos com 100 μL/alvéolo de albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em tampão de revestimento na concentração de 10 μg/ml. Esses poços adicionais servirão como controles de fundo.
NOTA: Recomenda-se revestir com BSA os poços de controle, pois os tampões de revestimento e bloqueio têm composições diferentes. Observe que outros peptídeos encefalitogênicos (como PLP139-151 ou MBP84-104) podem ser usados como antígenos irrelevantes em alternativa à BSA. - No dia seguinte, lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de solução salina tampão fosfato suplementada com 0,05% de Tween 20 (PBS-T). Em seguida, adicionar 100 μL/poço de uma solução de bloqueio feita de BSA a 3% em PBS (sem Tween 20) e incubar a placa selada por 1 h a 37 °C em um forno de hibridização.
- Lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de PBS-T. Diluir cada amostra de soro 1:100 em solução de bloqueio e adicionar 100 μL/alvéolo aos alvéolos revestidos com MOG35-55 e BSA. Adicione o mesmo volume de solução de bloqueio aos poços designados como brancos. Incubar a placa selada durante 2 h à temperatura ambiente, com agitação constante (250 rpm).
- Lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de PBS-T. Dilua o anticorpo secundário conjugado com HRP (1:2000, consulte a Tabela de Materiais) em uma solução feita de 0,2% de BSA em PBS-T e adicione 100 μL/poço a todos os poços. Incubar a placa selada durante 1 h à temperatura ambiente, com agitação constante (250 rpm).
- Lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de PBS-T. Adicione 100 μL / poço de substrato de 3,3 ', 5,5' tetrametilbenzidina (TMB) (consulte a Tabela de Materiais) a todos os poços e incube no escuro por 1-5 min, monitorando o desenvolvimento de uma cor azul.
- Pare a reação adicionando 100 μL / poço de solução de parada (consulte a Tabela de Materiais) e meça a densidade óptica (OD) em cada poço usando um leitor de placas ajustado em um comprimento de onda de 450 nm.
NOTA: O substrato TMB deve ser equilibrado à temperatura ambiente por 30-60 minutos antes de adicioná-lo aos poços.
- Pare a reação adicionando 100 μL / poço de solução de parada (consulte a Tabela de Materiais) e meça a densidade óptica (OD) em cada poço usando um leitor de placas ajustado em um comprimento de onda de 450 nm.
3. Análise dos dados
- Preencha uma planilha do Excel com os valores de OD lidos da placa. Calcule a média dos valores de DO obtidos de poços duplicados (revestidos com MOG35-55 e BSA) para cada amostra.
- Para cada amostra, subtrair o valor médio dos alvéolos revestidos com BSA do valor dos alvéolos revestidos com MOG35-55. Os valores corrigidos de fundo resultantes serão proporcionais à concentração de anticorpos anti-MOG35-55 nas diferentes amostras de soro.
NOTA: Os poços em branco devem resultar em valores corrigidos em torno de 0. - Aplicar um teste estatístico não paramétrico, como o teste U de Mann-Whitney, para comparar os valores médios de DO entre duas condições experimentais. Inclua pelo menos 3 amostras independentes para cada condição.
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Representative Results
Para demonstrar a robustez do presente ensaio ELISA, o método foi testado em amostras de soro isoladas de uma coorte de camundongos fêmeas C57BL/6J 20 dias pós-imunização (dpi) com 100 μg de peptídeo MOG35-55 em adjuvante de Freund completo (CFA) seguindo um protocolo de indução EAE validado 12,13,14. Os animais também receberam 400 ng de toxina pertussis nos dias 0 e 2. Amostras de soro de animais simulados imunizados com tudo, mas sem o peptídeo, serviram como controles negativos. Todos os camundongos EAE desenvolveram os primeiros sinais da doença entre 11-14 dpi e alcançaram em 20 dpi uma pontuação média de 2,6 ± 0,6 (erro padrão, SE) em uma escala de 0-6 (0, sem sinais; 1, diminuição do tônus da cauda; 2, monoparesia ou paraparesia leve; 3, paraparesia grave; 4, paraplegia; 5, quadriparesia; e 6, moribundo ou morte)12. Como esperado, as amostras EAE apresentaram valores de DO significativamente mais altos em comparação com as amostras controle (Figura 2). Esses dados confirmam a presença de uma resposta robusta de imunoglobulina IgG contra o peptídeo MOG no pico da doença.
Figura 1: Procedimento de punção cardíaca. (A-E) Imagens representativas do procedimento de toracotomia para acesso ao coração em camundongos adultos. (F) Imagem representativa do procedimento correto para inserção da agulha no ventrículo esquerdo do coração do camundongo. Estruturas anatômicas relevantes são indicadas em cada painel para facilitar a dissecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ELISA de autoanticorpo de peptídeo MOG. Os níveis séricos de imunoglobulinas IgG anti-MOG35-55 foram testados em EAE e camundongos simulados imunizados 20 dias após a imunização (dpi) usando o protocolo ELISA relatado. Valores de DO consistentemente mais altos foram detectados nas amostras de EAE em comparação com os controles. Os dados são apresentados como médias ± EP (N = 3 por grupo). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste U de Mann-Whitney unicaudal, *P ≤ 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, um protocolo simples e eficiente baseado em ELISA foi relatado para quantificar com precisão a resposta humoral em um modelo animal relevante de patologia de EM. Este método foi recentemente empregado para descrever o novo papel da proteína ataxina-1 no controle dos níveis séricos de autoanticorpos no paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE12. Nesse sentido, vários fatores devem ser levados em consideração, a fim de obter resultados consistentes e biologicamente significativos com esse método.
Primeiro, é crucial coletar amostras de soro de alta qualidade e evitar a hemólise. A hemoglobina e outros componentes intracelulares liberados dos glóbulos vermelhos em amostras fortemente hemolisadas podem interferir na reação antígeno-anticorpo e na medição da cor relativa no ensaio ELISA. Para prevenir a hemólise, é preferível evitar pressão negativa elevada na seringa durante a colheita de sangue, uma vez que pode causar a rutura dos eritrócitos.
Em segundo lugar, é importante diluir as amostras de soro para obter valores de DO dentro da porção linear da curva de absorbância. Nosso fator de diluição recomendado (1:100) foi calibrado na entidade da patologia EAE induzida em nossas linhagens de camundongos. Considerando o nível intrínseco de heterogeneidade deste modelo in vivo , é altamente recomendável realizar experimentos preliminares de titulação para identificar o fator de diluição ideal para a patologia específica da EAE que é testada. Do mesmo modo, os tempos de incubação com o substrato TMB podem ser ajustados para evitar a saturação do sinal cromogénico e manter os valores de DO dentro do intervalo de 0-2.
Em terceiro lugar, os valores de DO corrigidos obtidos neste protocolo são compatíveis com uma análise semiquantitativa dos títulos séricos de autoanticorpos entre diferentes condições experimentais ou para estudos cinéticos ao longo da progressão da doença. Se for necessária uma quantificação absoluta dos níveis de autoanticorpos, deve ser implementada uma curva de calibração no projeto ELISA. Vários anticorpos contra o peptídeo MOG estão disponíveis comercialmente e podem ser usados como padrões confiáveis para calcular a concentração de anticorpos específicos para MOG no soro de camundongos EAE. Para capturar efeitos de diferentes magnitudes, recomenda-se incluir uma ampla gama de diluições para o anticorpo calibrador (variando de concentrações de pg / mL a μg / mL).
Por fim, este protocolo é extremamente flexível e pode ser facilmente adaptado para acomodar diferentes necessidades de pesquisa. Por exemplo, o peptídeo encefalitogênico revestido pode ser variado para avaliar a resposta de autoanticorpos em outros paradigmas de EAE. Além disso, diferentes anticorpos secundários podem ser empregados para medir os níveis de classes distintas de imunoglobulinas. Para este fim, este protocolo demonstrou com sucesso que a ataxina-1 controla as classes IgG e IgM de anticorpos específicos do peptídeo MOG12. Por fim, pode-se vislumbrar um possível uso para detectar autoanticorpos no sangue de pacientes com EM. No entanto, existem diferenças substanciais entre as doenças EAE e EM. Enquanto o primeiro é induzido artificialmente por meio do aumento da resposta imune contra um autoantígeno bem definido com adjuvantes fortes, o último surge espontaneamente e nenhum autoantígeno inequívoco foi identificado ainda. Evidências recentes sugerem o possível envolvimento do mimetismo molecular com proteínas virais15. Portanto, as ressalvas devem sempre ser consideradas na tradução direta das observações coletadas neste modelo animal para a doença humana.
Em resumo, o presente protocolo representa uma alternativa fácil e conveniente aos kits ELISA comerciais e pode ser eficientemente combinado com outros métodos, como ensaios baseados em células (CBAs) para a estimativa precisa da liberação de autoanticorpos no contexto da desmielinização autoimune.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R03NS131908) e pelo Departamento de Defesa por meio do Programa de Pesquisa de Esclerose Múltipla sob o Prêmio nº W81XWH-22-1-0517. Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são de responsabilidade do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este estudo também foi apoiado por fundos de startups da East Carolina University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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