Summary
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.
Abstract
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 자가면역 질환인 다발성 경화증(MS)을 조직 병리학 및 분자 수준에서 요약하는 질병 모델입니다. EAE는 면역 반응을 높이기 위해 특정 보조제와 함께 짧은 미엘린 펩타이드의 피하 주사를 통해 실험 동물에게 면역을 유도합니다. 인간과 마찬가지로 EAE 마우스는 탈수초성 병변, 중추 신경계(CNS)로의 면역 세포 침투, 신경교 활성화 및 신경 세포 손상을 일으킵니다. 일관된 증거는 또한 MS와 EAE의 병인학에서 B 세포 기능 장애에 대한 기계론적 역할을 지지합니다. B 세포는 항원 제시 세포일 뿐만 아니라 전염증성 사이토카인 및 자가항체의 주요 공급원 역할을 할 수 있습니다. EAE에서는 질병을 유발하는 데 사용된 미엘린 펩티드에 대해 항체가 생성됩니다. 이러한 자가항체는 미엘린 손실 또는 병원성 T 세포가 중추신경계로 재활성화되는 것을 매개하는 것으로 나타났습니다. 이 논문에서는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 35-55(MOG35-55) 펩타이드로 면역된 C57BL/6J 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 효율적인 ELISA 기반 프로토콜에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 자가면역 탈수초화의 맥락에서 비정상적인 체액성 반응의 특이성과 규모를 조사하는 강력한 도구 역할을 합니다.
Introduction
다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)의 만성 자가면역 질환으로, 면역 세포가 뇌 실질로 국소적으로 침투하고, 축삭을 감싸고 있는 미엘린 수초의 파괴, 신경교세포 활성화 및 신경 세포 소실을 특징으로 합니다1. 병원성 T 세포의 잘 확립된 역할 외에도 여러 증거에 따르면 B 세포가 중추신경계에 대한 자가면역 반응을 매개하는 데 관여한다는 사실이 밝혀졌습니다. B 세포는 MS 뇌에서 클론 확장을 겪으며 미엘린 성분에 대한 항체가 탈수초화 병변 2,3에서 검출되었습니다. 질병 발병 시 말초 B 세포의 선택적 활성화가 최근에 문서화되었으며, 이는 질병 시작에서도 이 면역 세포 구획의 추정적인 역할을 시사합니다4. 항-CD20 단클론 항체와 같은 B 세포 고갈 요법의 성공은 비정상적인 B 세포 기능과 자가면역 탈수초화 사이의 기계론적 연결을 더욱 확증합니다 5,6. 분자적 관점에서 B 세포는 자가항원 제시, 전염증성 사이토카인 분비 및 자가반응성 항체 생성을 통해 질병에 기여할 수 있습니다.
복잡한 MS 표현형의 특정 특징을 요약하기 위해 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 그 중 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 in vivo 패러다임에서 가장 널리 사용되는 패러다임으로, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) 및 미엘린 염기성 단백질(MBP)과 같은 미엘린 단백질에서 유래한 짧은 펩타이드로 실험 동물에 대한 면역에 의존합니다7. EAE 면역 동물은 뇌생성 펩타이드8에 대한 강력한 체액성 반응을 포함하여 여러 측면에서 MS와 유사한 탈수초화 병리를 개발합니다. 이러한 이유로 EAE 연구는 질병의 맥락에서 B 세포와 자가항체의 기능을 해부하는 데 중요한 역할을 했습니다. 예를 들어, 다발성경화증 환자로부터 분리한 MOG 특이적 항체가 EAE 모델9에서 임상 경과를 악화시킬 수 있음이 입증되었다. 특히, 인간 MOG에서 위치 42의 프롤린 잔기는 자가항체 병원성을 결정하는 데 중요한 것으로 나타났다10. 보다 최근에는 MOG 특이적 자가항체가 미엘린 손실을 매개할 뿐만 아니라 CNS11 내에서 자가반응성 T 세포의 재활성화를 촉진함으로써 질병을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다.
중추신경계(CNS) 자가면역에서 항체 반응의 중요성을 고려하여, 이 논문에서는 MOG35-55 펩타이드로 면역된 C57BL/6J 마우스 EAE에서 자가반응성 항체의 혈청 수준을 효율적으로 측정하기 위한 ELISA 기반 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 심장 내 천자를 통해 혈청을 수집하는 방법에 대해 설명합니다. 그 후, ELISA 분석을 설정하고 데이터를 획득하는 절차가 자세히 설명됩니다. 마지막으로 데이터 분석 및 해석에 대해 설명합니다.
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Protocol
마우스와 관련된 모든 절차는 East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에서 승인한 실험 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 생후 8-10주 사이의 Wildtype C57BL/6J 암컷 마우스를 사용했습니다. 동물은 상업적인 출처에서 얻었다(재료 표 참조). EAE는 이전에 발표된 보고서 12,13,14에 따라 유도되었습니다.
1. 세럼 수집
- MOG35-55 면역을 통해 EAE를 유도한 후 필요한 시점(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름)에 CO2 질식 또는 이소플루란 과다 투여로 실험용 마우스를 안락사시킵니다.
참고: 총 마우스 수와 혈청 채취 시점은 특정 실험에 따라 달라질 수 있습니다. - 발가락이나 꼬리 꼬집기로 활력 징후가 없음을 확인한 후 마우스를 해부 트레이의 등쪽 누운 위치에 놓고 핀이나 테이프로 팔다리를 제자리에 고정합니다. 마우스 몸체를 LED 광원( 재료 표 참조)으로 향하게 하여 동물의 흉부를 비춥니다.
- 쥐 털에 70% 에탄올을 뿌리고 해부 가위를 사용하여 골반에서 시푸드까지 복부를 따라 3-4cm의 정중선을 절개하고 장기와 주요 혈관을 피하도록 주의합니다(그림 1A-C). 절차를 용이하게 하려면 집게를 사용하여 xiphoid 돌기 위의 피부를 잡습니다.
- 횡격막을 측면으로 절단한 다음 스프링 가위를 사용하여 양쪽 측면 가장자리에서 흉곽을 전방으로 절단하고 정중선의 흉골에 도달하기 전에 멈춥니다(그림 1D). 마우스 머리 위에 만든 갈비뼈 플랩을 접어 심장을 노출시킵니다(그림 1E).
참고: 흉골을 절단하는 것은 뼈에 인접한 주요 흉부 동맥을 손상시키고 수집할 수 있는 혈액의 양을 감소시키므로 피해야 합니다. - 1mL 주사기에 연결된 25G 바늘을 좌심실에 삽입하고 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 혈액을 채취합니다(그림 1F). 바늘에 구멍을 쉽게 뚫으려면 한 쌍의 집게로 심장을 부드럽게 받쳐줍니다.
알림: 혈액이 주사기에 즉시 나타나지 않으면 바늘을 천천히 돌리고 다른 각도로 테스트해야 합니다. 그러나 혈액이 누출될 수 있는 불필요한 구멍을 심장에 만들지 않도록 첫 번째 시도에서 바늘을 올바르게 배치하도록 노력해야 합니다. - 혈액을 멸균된 1.5mL 튜브로 옮기고 실온에서 30분 동안 응고시킵니다. 4°C에서 20분 동안 2000×g에서 원심분리하여 응고를 제거합니다. 혈청 분획을 나타내는 상층액을 수집하고 향후 테스트를 위해 -80°C의 극저온 튜브에 일회용 분취액을 저장합니다.
2. ELISA 분석
- 동결건조된 MOG35-55 펩타이드( 재료 표 참조)를 물에 재현탁시켜 10mg/mL 스톡을 얻습니다. 실험을 시작하기 전에 코팅 완충액( 재료 표 참조)에서 스톡을 10μg/mL로 희석하고 최종 용액 100μL/웰을 96웰 플레이트에 피펫팅합니다. 증발을 방지하기 위해 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
참고: 각 샘플에 대해 최소 2개의 웰을 계산해야 하며 빈 대조군에 대해 2개의 추가 웰도 포함되어야 합니다. - 이와 동시에 10μg/mL 농도의 코팅 버퍼에 용해된 소 혈청 알부민(BSA) 100μL/웰로 동일한 수의 웰을 코팅합니다. 이러한 추가 우물은 배경 제어 역할을 합니다.
NOTE: 코팅 및 차단 완충액의 조성이 다르기 때문에 컨트롤 웰을 BSA로 코팅하는 것이 권장됩니다. 다른 뇌염성 펩티드(예: PLP139-151 또는 MBP84-104)는 BSA 대체품으로 관련 없는 항원으로 사용될 수 있습니다. - 다음날 0.05% Tween 20(PBS-T)이 보충된 200μL/웰의 인산염 완충 식염수로 플레이트를 3번 세척합니다. 그 후, PBS에서 3% BSA로 만든 차단 용액 100μL/웰을 추가하고(Tween 20 제외) 혼성화 오븐에서 37°C에서 1시간 동안 밀봉된 플레이트를 배양합니다.
- PBS-T 200μL/웰로 플레이트를 3회 세척합니다. 각 혈청 샘플을 차단 용액에 1:100으로 희석하고 MOG35-55 및 BSA 코팅 웰 모두에 100μL/웰을 추가합니다. 블랭크로 지정된 웰에 동일한 부피의 차단 용액을 추가합니다. 실온에서 일정한 흔들림(250rpm)으로 2시간 동안 밀봉된 플레이트를 배양합니다.
- PBS-T 200μL/웰로 플레이트를 3회 세척합니다. PBS-T의 0.2% BSA로 만든 용액에 HRP 접합 2차 항체(1:2000, 재료 표 참조)를 희석하고 모든 웰에 100μL/웰을 추가합니다. 실온에서 일정한 흔들림(250rpm)으로 1시간 동안 밀봉된 플레이트를 배양합니다.
- PBS-T 200μL/웰로 플레이트를 3회 세척합니다. 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질( 재료 표 참조)의 100μL/웰을 모든 웰에 추가하고 어두운 곳에서 1-5분 동안 배양하여 파란색이 나타나는 것을 모니터링합니다.
- 100 μL/웰의 정지 용액( 재료 표 참조)을 추가하여 반응을 중지하고 450nm 파장으로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
참고: TMB 기판은 웰에 추가하기 전에 실온에서 30-60분 동안 평형을 이루어야 합니다.
- 100 μL/웰의 정지 용액( 재료 표 참조)을 추가하여 반응을 중지하고 450nm 파장으로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
3. 데이터 분석
- 플레이트에서 읽은 OD 값으로 Excel 스프레드시트를 채웁니다. 각 샘플에 대해 중복 웰(MOG35-55 및 BSA 코팅 모두)에서 얻은 OD 값의 평균을 구합니다.
- 각 샘플에 대해 MOG35-55 코팅 웰의 평균값에서 BSA 코팅 웰의 평균값을 뺍니다. 결과 배경 보정 값은 서로 다른 혈청 샘플의 항-MOG35-55 항체 농도에 비례합니다.
참고: 빈 웰은 약 0 부근에서 수정된 값을 가져와야 합니다. - Mann-Whitney U 검정과 같은 비모수 통계 검정을 적용하여 두 실험 조건 간의 평균 OD 값을 비교합니다. 각 조건에 대해 3개 이상의 독립 표본을 포함합니다.
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Representative Results
본 ELISA 분석의 견고성을 입증하기 위해, 이 방법은 검증된 EAE 유도 프로토콜 12,13,14에 따라 완전한 Freund's adjuvant(CFA)에서 100μg의 MOG35-55 펩타이드와 함께 면역 20일(dpi) 후 C57BL/6J 암컷 마우스 코호트에서 분리한 혈청 샘플에서 테스트되었습니다. 동물들은 또한 0일째와 2일째에 400ng의 백일해 독소를 받았습니다. 펩타이드를 사용하지 않은 모든 것을 갖춘 모의 면역 동물의 혈청 샘플은 음성 대조군으로 작용했습니다. 모든 EAE 마우스는 11-14 dpi 사이에 질병의 첫 징후를 보였고 20 dpi까지 0-6 척도에서 평균 점수 2.6 ± 0.6 (표준 오류, SE)에 도달했습니다 (0, 징후 없음; 1, 꼬리 톤 감소; 2, 경미한 단마비 또는 마비; 3, 심한 마비; 4, 하반신 마비; 5, 사지 마비; 및 6, 사망 또는 사망)12. 예상대로 EAE 샘플은 대조 샘플에 비해 훨씬 더 높은 OD 값을 나타냈습니다(그림 2). 이러한 데이터는 질병이 최고조에 달했을 때 MOG 펩타이드에 대한 강력한 IgG 면역글로불린 반응의 존재를 확인합니다.
그림 1: 심장 천자 절차. (A-E) 성인 마우스에서 심장에 접근하기 위한 개흉술 절차의 대표 이미지. (F) 마우스 심장의 좌심실에 바늘을 삽입하는 올바른 절차의 대표 이미지. 관련 해부학적 구조가 각 패널에 표시되어 해부를 용이하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MOG 펩타이드 자가항체 ELISA. 항-MOG35-55 IgG 면역글로불린의 혈청 수치는 보고된 ELISA 프로토콜을 사용하여 EAE에서 테스트하고 면역 후 20일(dpi)에 면역화된 마우스를 모의 테스트했습니다. 대조군에 비해 EAE 샘플에서 일관되게 더 높은 OD 값이 감지되었습니다. 데이터는 SE± 평균으로 표시됩니다(그룹당 N = 3). 그룹 간의 차이는 단측 Mann-Whitney U 검정, *P ≤ 0.05로 평가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서, MS 병리학의 관련 동물 모델에서 체액성 반응을 정확하게 정량화하는 간단하고 효율적인 ELISA 기반 프로토콜이 보고되었습니다. 이 방법은 최근 MOG35-55/C57BL6J EAE 패러다임12에서 자가항체의 혈청 수준을 조절하는 아탁신-1 단백질의 새로운 역할을 설명하기 위해 사용되었습니다. 이와 관련하여, 이 방법으로 일관되고 생물학적으로 의미 있는 결과를 얻기 위해 여러 요인을 고려해야 합니다.
첫째, 고품질 혈청 샘플을 수집하고 용혈을 피하는 것이 중요합니다. 심하게 용혈된 표본의 적혈구에서 방출되는 헤모글로빈 및 기타 세포 내 구성 요소는 ELISA 분석에서 항원-항체 반응 및 상대 색상 측정을 방해할 수 있습니다. 용혈을 예방하기 위해서는 채혈 시 주사기에 높은 음압을 가하면 적혈구가 파열될 수 있으므로 피하는 것이 좋습니다.
둘째, 흡광도 곡선의 선형 부분 내에서 OD 값을 얻기 위해 혈청 샘플을 희석하는 것이 중요합니다. 당사의 권장 희석 계수(1:100)는 마우스 균주에서 유도된 EAE 병리학의 실체에 대해 보정되었습니다. 이 in vivo 모델의 내재적 수준의 이질성을 고려할 때, 테스트되는 특정 EAE 병리학에 대한 이상적인 희석 계수를 식별하기 위해 예비 적정 실험을 수행하는 것이 적극 권장됩니다. 마찬가지로, TMB 기질과의 배양 시간은 발색 신호의 포화를 피하고 OD 값을 0-2 범위 내에서 유지하기 위해 조정될 수 있습니다.
셋째, 이 프로토콜에서 얻어진 보정된 OD 값은 서로 다른 실험 조건 간의 자가항체 혈청 역가의 반정량 분석 또는 질병 진행에 따른 역학 연구와 호환됩니다. 자가항체 수준의 절대 정량화가 필요한 경우, ELISA 설계에서 보정 곡선을 구현해야 합니다. MOG 펩타이드에 대한 여러 항체는 상업적으로 이용 가능하며 EAE 마우스의 혈청 내 MOG 특이적 항체의 농도를 계산하기 위한 신뢰할 수 있는 표준물질로 사용할 수 있습니다. 다양한 규모의 효과를 포착하려면 보정 항체에 대한 광범위한 희석액(pg/mL에서 μg/mL 농도 범위)을 포함하는 것이 좋습니다.
마지막으로, 이 프로토콜은 매우 유연하며 다양한 연구 요구 사항을 수용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 코팅된 뇌생성 펩타이드는 다른 EAE 패러다임에서 자가항체 반응을 평가하기 위해 다양할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 2차 항체를 사용하여 뚜렷한 면역글로불린 등급의 수준을 측정할 수 있습니다. 이를 위해 이 프로토콜은 아탁신-1이 MOG 펩타이드 특이적 항체12의 IgG 및 IgM 클래스를 모두 제어한다는 것을 성공적으로 입증했습니다. 마지막으로, 다발성경화증 환자의 혈액에서 자가항체를 검출하는 데 사용할 수 있는 방법을 구상할 수 있습니다. 그러나 EAE와 다발성경화증 질환 사이에는 상당한 차이가 있습니다. 전자는 강력한 보조제로 잘 정의된 자가항원에 대한 면역 반응을 촉진 하여 인위적으로 유도되는 반면, 후자는 자발적으로 발생하며 명확한 자가항원은 아직 확인되지 않았습니다. 최근의 증거는 분자 모방이 바이러스 단백질과 관련이 있을 수 있음을 시사한다15. 따라서 이 동물 모델에서 수집된 관찰 결과를 인간 질병에 직접 적용할 때 항상 주의 사항을 고려해야 합니다.
요약하면, 본 프로토콜은 상용 ELISA 키트에 대한 쉽고 편리한 대안을 나타내며 자가면역 탈수초화의 맥락에서 자가항체 방출의 정확한 추정을 위해 세포 기반 분석(CBA)과 같은 다른 방법과 효율적으로 결합될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R03NS131908)과 국방부(Department of Defense)의 다발성 경화증 연구 프로그램(Multiple Sclerosis Research Program)의 지원을 받았습니다(Award No. W81XWH-22-1-0517). 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 것이며 국방부에서 반드시 보증하는 것은 아닙니다. 이 연구는 이스트 캐롤라이나 대학의 창업 자금도 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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