Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

요약

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

초록

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 자가면역 질환인 다발성 경화증(MS)을 조직 병리학 및 분자 수준에서 요약하는 질병 모델입니다. EAE는 면역 반응을 높이기 위해 특정 보조제와 함께 짧은 미엘린 펩타이드의 피하 주사를 통해 실험 동물에게 면역을 유도합니다. 인간과 마찬가지로 EAE 마우스는 탈수초성 병변, 중추 신경계(CNS)로의 면역 세포 침투, 신경교 활성화 및 신경 세포 손상을 일으킵니다. 일관된 증거는 또한 MS와 EAE의 병인학에서 B 세포 기능 장애에 대한 기계론적 역할을 지지합니다. B 세포는 항원 제시 세포일 뿐만 아니라 전염증성 사이토카인 및 자가항체의 주요 공급원 역할을 할 수 있습니다. EAE에서는 질병을 유발하는 데 사용된 미엘린 펩티드에 대해 항체가 생성됩니다. 이러한 자가항체는 미엘린 손실 또는 병원성 T 세포가 중추신경계로 재활성화되는 것을 매개하는 것으로 나타났습니다. 이 논문에서는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 35-55(MOG35-55) 펩타이드로 면역된 C57BL/6J 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 효율적인 ELISA 기반 프로토콜에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 자가면역 탈수초화의 맥락에서 비정상적인 체액성 반응의 특이성과 규모를 조사하는 강력한 도구 역할을 합니다.

서론

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)의 만성 자가면역 질환으로, 면역 세포가 뇌 실질로 국소적으로 침투하고, 축삭을 감싸고 있는 미엘린 수초의 파괴, 신경교세포 활성화 및 신경 세포 소실을 특징으로 합니다¹. 병원성 T 세포의 잘 확립된 역할 외에도 여러 증거에 따르면 B 세포가 중추신경계에 대한 자가면역 반응을 매개하는 데 관여한다는 사실이 밝혀졌습니다. B 세포는 MS 뇌에서 클론 확장을 겪으며 미엘린 성분에 대한 항체가 탈수초화 병변 ^2,3에서 검출되었습니다. 질병 발병 시 말초 B 세포의 선택적 활성화가 최근에 문서화되었으며, 이는 질병 시작에서도 이 면역 세포 구획의 추정적인 역할을 시사합니다⁴. 항-CD20 단클론 항체와 같은 B 세포 고갈 요법의 성공은 비정상적인 B 세포 기능과 자가면역 탈수초화 사이의 기계론적 연결을 더욱 확증합니다 ^5,6. 분자적 관점에서 B 세포는 자가항원 제시, 전염증성 사이토카인 분비 및 자가반응성 항체 생성을 통해 질병에 기여할 수 있습니다.

프로토콜

마우스와 관련된 모든 절차는 East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에서 승인한 실험 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 생후 8-10주 사이의 Wildtype C57BL/6J 암컷 마우스를 사용했습니다. 동물은 상업적인 출처에서 얻었다(재료 표 참조). EAE는 이전에 발표된 보고서 12,13,14에 따라 유도되었습니다.

1. 세럼 수집

1. MOG35-55 면역을 통해 EAE를 유도한 후 필요한 시점(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름)에 CO₂ 질식 또는 이소플루란 과다 투여로 실험용 마우스를 안락사시킵니다.
   참고: 총 마우스 수와 혈청 채취 시점은 특정 실험에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 발가락이나 꼬리 꼬집기로 활력 징후가 없음을 확인한 후 마우스를 해부 트레이의 등쪽 누운 위치에 놓고 핀이나 테이프로 팔다리를 제자리에 고정합니다. 마우스 ....

결과

본 ELISA 분석의 견고성을 입증하기 위해, 이 방법은 검증된 EAE 유도 프로토콜 12,13,14에 따라 완전한 Freund's adjuvant(CFA)에서 100μg의 MOG35-55 펩타이드와 함께 면역 20일(dpi) 후 C57BL/6J 암컷 마우스 코호트에서 분리한 혈청 샘플에서 테스트되었습니다. 동물들은 또한 0일째와 2일째에 400ng의 백일해 독소를 받았습니다. 펩타이드를 사용하지 않은 모든 것을 갖춘 모의 면역 동물의 혈청 샘플은 음성 대조군으로 작용했습니다. 모든 EAE 마우스는 11-14 dpi 사이에 질병의 첫 징후를 보였고 20 dpi까지 0-6 척도에서 평균 점수 2.6 ± 0.6 (표준 오류, SE)에 도달했습니다 (0, 징후 없음; 1, 꼬리 톤 감소; 2, 경미한 단마비 또는 마비; 3, 심한 마비; 4, 하반신 마비; 5, 사지 .......

토론

여기에서, MS 병리학의 관련 동물 모델에서 체액성 반응을 정확하게 정량화하는 간단하고 효율적인 ELISA 기반 프로토콜이 보고되었습니다. 이 방법은 최근 MOG35-55/C57BL6J EAE 패러다임¹²에서 자가항체의 혈청 수준을 조절하는 아탁신-1 단백질의 새로운 역할을 설명하기 위해 사용되었습니다. 이와 관련하여, 이 방법으로 일관되고 생물학적으로 의미 있는 결과를 얻기 위해 여러 요인을 고려해야 합니다.

첫째, 고품질 혈청 샘플을 수집하고 용혈을 피하는 것이 중요합니다. 심하게 용혈된 표본의 적혈구에서 방출되는 헤모글로빈 및 기타 세포 내 구성 요소는 ELISA 분석에서 항원-항체 반응 및 상대 색상 측정을 방해할 수 있습니다. 용혈을 예방하기 위해서는 채혈 시 주사기에 높은 음압을 가하면 적혈구가 파열될 수 있으므로 피하는 것이 좋습니다.

둘째, 흡광도 곡선의 선형 부분 내에서 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL 주사기	BD Biosciences	309628
1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브	Fisher	05-408-129
25 G 바늘	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 기질	Thermo Fisher	N301	4 °에 저장; C
접착 씰	Thermo Fisher	AB0558
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma	A7906	4 °에 저장; C
C57BL / 6J 암컷 마우스	The Jackson Laboratory	000664	8-10 주 사이의 동물은 EAE 실험에 사용해야합니다
극저온 튜브	Fisher	10-500-25
해부 트레이	Fisher	S111022
해부 가위	Fine Science Tools	14082-09
ELISA 코팅 버퍼	BioLegend	421701	4°C에 저장; C
엑셀 소프트웨어	마이크로 소프트		분석 스프레드 시트
집게	파인 사이언스 도구	11152-10
염소 안티 마우스 IgG, 인간 광고 - HRP	SouthernBiotech	1030-05	4 °에 저장; C
LED 광원	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
분자 생물학 등급 물	Corning	46-000-Cl
마우스 MOG35-55 펩타이드	EZBiolab	cp7203	-80 °에서 보관; C
다중 채널 피펫	Axygen	AP-12-200-P
Noyes 스프링 가위	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
인산염 완충 식염수(PBS)	Thermo Fisher	14190144
냉장 탁상용 원심분리기	Thermo Fisher	75002441
Stop 솔루션	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531