Summary
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en djurmodell av multipel skleros (MS), som delar ett robust humoralt autoimmunt svar med den mänskliga sjukdomen. Här rapporterar vi ett enkelt och flexibelt ELISA-protokoll för att kvantifiera autoantikroppar i serum från EAE-immuniserade möss.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en sjukdomsmodell som rekapitulerar den autoimmuna sjukdomen multipel skleros (MS) på histopatologisk och molekylär nivå. EAE induceras genom immunisering av försöksdjur via subkutan injektion av korta myelinpeptider tillsammans med specifika adjuvans för att öka immunsvaret. Liksom den mänskliga motsvarigheten utvecklar EAE-möss demyeliniserande lesioner, immuncellsinfiltration i centrala nervsystemet (CNS), gliaaktivering och neuronal skada. En konsekvent mängd bevis stöder också en mekanistisk roll för B-cellsdysfunktion i etiologin för både MS och EAE. B-celler kan fungera som antigenpresenterande celler såväl som en primär källa till pro-inflammatoriska cytokiner och autoantikroppar. Vid EAE bildas antikroppar mot de myelinpeptider som användes för att inducera sjukdomen. Sådana autoantikroppar har visat sig mediera antingen myelinförlust eller patogen T-cellsreaktivering i CNS. Denna artikel beskriver ett effektivt ELISA-baserat protokoll för att kvantifiera autoantikroppar i serum hos C57BL/6J-möss som immuniserats med myelinoligodendrocytglykoprotein 35-55 (MOG35-55) peptid. Den föreslagna metoden fungerar som ett kraftfullt verktyg för att undersöka specificiteten och omfattningen av den avvikande humorala responsen i samband med autoimmun demyelinisering.
Introduction
Multipel skleros (MS) är en kronisk autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som kännetecknas av fokal infiltration av immunceller i hjärnans parenkym, nedbrytning av myelinskidor som omsluter axoner, gliaaktivering och neuronal förlust1. Förutom den väletablerade roll som patogena T-celler har, har flera bevis belyst B-cellers inblandning i att förmedla det autoimmuna svaret mot CNS. B-celler genomgår klonal expansion i MS-hjärnan och antikroppar mot myelinkomponenter har påvisats inom demyeliniserade lesioner 2,3. Den selektiva aktiveringen av perifera B-celler vid sjukdomsdebut har nyligen dokumenterats, vilket tyder på en förmodad roll för detta immuncellskompartment i sjukdomsinitiering också4. Framgången med B-cellsnedbrytande terapier såsom monoklonala antikroppar mot CD20 bekräftar ytterligare det mekanistiska sambandet mellan avvikande B-cellsfunktion och autoimmun demyelinisering 5,6. Ur molekylär synvinkel kan B-celler bidra till sjukdom via presentation av autoantigen, pro-inflammatorisk cytokinsekretion och autoreaktiv antikroppsproduktion.
Flera djurmodeller har utvecklats för att rekapitulera specifika egenskaper hos den komplexa MS-fenotypen. Bland dem är experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) det mest använda in vivo-paradigmet och bygger på immunisering av försöksdjur med korta peptider som härrör från myelinproteiner såsom myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) och myelinbasprotein (MBP)7. EAE-immuniserade djur utvecklar en demyeliniserande patologi som liknar MS i många aspekter, inklusive ett robust humoralt svar mot den encefalitogena peptiden8. Av denna anledning har EAE-studier varit avgörande för att dissekera funktionen hos B-celler och autoantikroppar i samband med sjukdom. Till exempel visades det att MOG-specifika antikroppar isolerade från MS-patienter kan förvärra det kliniska förloppet i EAE-modeller9. Noterbart är att prolinresterna vid position 42 i human MOG visade sig vara avgörande för att bestämma autoantikroppspatogenicitet10. På senare tid har MOG-specifika autoantikroppar visat sig främja sjukdom inte bara genom att mediera myelinförlust utan också genom att öka reaktiveringen av autoreaktiva T-celler inom CNS11.
Med tanke på vikten av antikroppssvar vid CNS-autoimmunitet presenterar denna artikel ett ELISA-baserat protokoll för att effektivt mäta serumnivåerna av autoreaktiva antikroppar hos C57BL/6J-möss EAE immuniserade med MOG35-55-peptid. I den första delen av protokollet kommer metoden för att samla in serum via intrakardiell punktion att beskrivas. Därefter kommer procedurerna för att ställa in ELISA-analysen och samla in data att vara detaljerade. Slutligen kommer dataanalys och tolkning att diskuteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar möss utfördes i enlighet med experimentella riktlinjer som godkänts av East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Vildtyp C57BL/6J honmöss mellan 8-10 veckors ålder användes i denna studie. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning). EAE inducerades enligt tidigare publicerade rapporter 12,13,14.
1. Insamling av serum
- Avliva den experimentella musen genom CO2 -kvävning eller överdosering av isofluran vid erforderlig tidpunkt (enligt institutionellt godkända protokoll) efter inducering av EAE via MOG35-55-immunisering.
OBS: Det totala antalet möss och tidpunkter för seruminsamling kan variera beroende på det specifika experimentet. - Efter att frånvaron av vitala tecken har bekräftats av en tå eller svansnyp, placera musen i en dorsal liggande position på en dissektionsbricka och fäst lemmarna på plats med stift eller tejp. Rikta muskroppen mot LED-ljuskällan (se materialtabell) för att belysa djurets bröstkorg.
- Spraya muspälsen med 70 % etanol och gör ett snitt i mitten av buken från bäckenet till xiphoiden med hjälp av dissekeringssaxen, var noga med att undvika organ och större kärl (Figur 1A-C). För att underlätta proceduren, använd pincetten för att ta tag i huden över xiphoid-processen.
- Skär genom membranet i sidled och klipp sedan av bröstkorgen framtill på båda sidokanterna med hjälp av fjädersaxen, stanna innan du når bröstbenet vid mittlinjen (Figur 1D). Vik revbensfliken som skapades över mushuvudet för att exponera hjärtat (Figur 1E).
OBS: Skärning av bröstbenet bör undvikas eftersom detta kommer att skada de viktigaste bröstartärerna som ligger intill benet och minska volymen blod som kan samlas in. - Stick in en 25 G nål ansluten till en 1 ml spruta i vänster kammare och samla upp blodet genom att försiktigt dra tillbaka kolven (Figur 1F). För att underlätta nålpunktionen, spänn försiktigt hjärtat mot en pincett.
OBS: Om blodet inte kommer upp omedelbart i sprutan ska nålen roteras långsamt och en annan vinkel ska testas. Man bör dock försöka placera nålen ordentligt vid första försöket för att undvika att skapa onödiga hål i hjärtat där blod kan läcka ut. - Överför blodet till ett sterilt 1,5 ml rör och låt det koagulera i 30 minuter i rumstemperatur. Avlägsna proppen genom centrifugering vid 2000 × g i 20 minuter vid 4 °C. Samla in supernatanten, som representerar serumfraktionen, och förvara alikvoter för engångsbruk i kryogena rör vid -80 °C för framtida testning.
2. ELISA-analys
- Återsuspendera den frystorkade MOG35-55-peptiden (se Materialförteckning) i vatten för att erhålla en 10 mg/ml stam. Innan experimentet påbörjas, späd materialet till 10 μg/ml i beläggningsbuffert (se Materialtabell) och pipettera över 100 μL/brunn av den slutliga lösningen till en platta med 96 hål. Försegla plattan med en självhäftande film för att undvika avdunstning och inkubera plattan över natten vid 4 °C.
OBS: Minst 2 brunnar bör beräknas för varje prov och 2 ytterligare brunnar bör också inkluderas för en blindkontroll. - Täck parallellt samma antal brunnar med 100 μl bovint serumalbumin (BSA) löst i en buffert med beläggning vid en koncentration på 10 μg/ml. Dessa ytterligare brunnar kommer att fungera som bakgrundskontroller.
OBS: Det rekommenderas att belägga kontrollbrunnarna med BSA eftersom beläggnings- och blockeringsbuffertarna har olika sammansättningar. Observera att andra encefalitogena peptider (t.ex. PLP139-151 eller MBP84-104) kan användas som irrelevanta antigener i alternativ till BSA. - Dagen efter, tvätta plattan 3 gånger med 200 μL/brunn fosfatbuffert koksaltlösning kompletterad med 0,05 % Tween 20 (PBS-T). Tillsätt därefter 100 μl/brunn av en blockerande lösning bestående av 3 % BSA i PBS (utan Tween 20) och inkubera plattan som är förseglad i 1 timme vid 37 °C i en hybridiseringsugn.
- Tvätta plattan 3 gånger med 200 μL/brunn PBS-T. Späd varje serumprov 1:100 i blockerande lösning och tillsätt 100 μL/brunn till både MOG35-55 och BSA-belagda brunnar. Tillsätt samma volym blockerande lösning till de brunnar som betecknas som blindprov. Inkubera plattan förseglad i 2 timmar vid rumstemperatur, med konstant skakning (250 rpm).
- Tvätta plattan 3 gånger med 200 μL/brunn PBS-T. Späd den HRP-konjugerade sekundära antikroppen (1:2000, se Materialtabell) i en lösning bestående av 0,2 % BSA i PBS-T och tillsätt 100 μL/brunn till alla brunnar. Inkubera plattan förseglad i 1 timme vid rumstemperatur, med konstant skakning (250 rpm).
- Tvätta plattan 3 gånger med 200 μL/brunn PBS-T. Tillsätt 100 μl/brunn av 3,3',5,5'-substrat av tetrametylbenzidin (TMB) (se materialtabell) till alla brunnar och inkubera i mörker i 1-5 minuter, under övervakning av utvecklingen av en blå färg.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 μL/brunn stopplösning (se Materialtabell) och mät den optiska densiteten (OD) i varje brunn med hjälp av en plattläsare inställd på en våglängd på 450 nm.
OBS: TMB-substratet bör vara i jämvikt vid rumstemperatur i 30-60 minuter innan det tillsätts i brunnarna.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 μL/brunn stopplösning (se Materialtabell) och mät den optiska densiteten (OD) i varje brunn med hjälp av en plattläsare inställd på en våglängd på 450 nm.
3. Analys av data
- Fyll i ett Excel-kalkylblad med OD-värdena som läses från plattan. Medelvärdet av de OD-värden som erhållits från dubbla brunnar (både MOG35-55 och BSA-belagda) för varje prov.
- För varje prov, subtrahera medelvärdet för de BSA-belagda brunnarna från det för MOG35-55-belagda brunnar. De resulterande bakgrundskorrigerade värdena kommer att vara proportionella mot koncentrationen av anti-MOG35-55-antikroppar i de olika serumproverna.
OBS: Tomma brunnar bör resultera i korrigerade värden runt 0. - Tillämpa ett icke-parametriskt statistiskt test som Mann-Whitney U-testet för att jämföra de genomsnittliga OD-värdena mellan två experimentella förhållanden. Inkludera minst 3 oberoende prover för varje tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera robustheten hos den aktuella ELISA-analysen testades metoden på serumprover isolerade från en kohort av C57BL/6J-honmöss 20 dagar efter immunisering (dpi) med 100 μg MOG35-55-peptid i komplett Freunds adjuvans (CFA) enligt ett validerat EAE-induktionsprotokoll 12,13,14. Djuren fick också 400 ng kikhostetoxin på dag 0 och 2. Serumprover från låtsasimmuniserade djur med allt men utan peptiden fungerade som negativa kontroller. Alla EAE-möss utvecklade de första tecknen på sjukdom mellan 11-14 dpi och uppnådde med 20 dpi en genomsnittlig poäng på 2,6 ± 0,6 (standardfel, SE) på en skala 0-6 (0, inga tecken; 1, minskad svanston; 2, mild monopares eller parapares; 3, svår parapares; 4, paraplegi; 5, quadripares; och 6, döende eller död)12. Som förväntat visade EAE-proverna signifikant högre OD-värden jämfört med kontrollproverna (Figur 2). Dessa data bekräftar närvaron av ett robust IgG-immunglobulinsvar mot MG-peptiden vid toppen av sjukdomen.
Figur 1: Hjärtpunktion. (A-E) Representativa bilder av torakotomiproceduren för att komma åt hjärtat hos vuxna möss. F) Representativ bild av den korrekta proceduren för nålstick i vänster kammare i mushjärtat. Relevanta anatomiska strukturer anges i varje panel för att underlätta dissektionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: ELISA-autoantikropp mot MOG-peptider. Serumnivåer av anti-MOG35-55 IgG-immunglobuliner testades på EAE- och låtsasimmuniserade möss 20 dagar efter immunisering (dpi) med hjälp av det rapporterade ELISA-protokollet. Genomgående högre OD-värden detekterades i EAE-prover jämfört med kontroller. Data presenteras som medelvärden ± SE (N = 3 per grupp). Skillnader mellan grupperna bedömdes med ensidigt Mann-Whitney U-test, *P ≤ 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här rapporterades ett enkelt och effektivt ELISA-baserat protokoll för att exakt kvantifiera det humorala svaret i en relevant djurmodell av MS-patologi. Denna metod har nyligen använts för att beskriva den nya roll som ataxin-1-proteinet spelar för att kontrollera serumnivåerna av autoantikroppar i MOG35-55/C57BL6J EAE-paradigm12. I detta avseende bör ett antal faktorer beaktas för att uppnå konsekventa och biologiskt meningsfulla resultat med denna metod.
För det första är det viktigt att samla in serumprover av hög kvalitet och undvika hemolys. Hemoglobin och andra intracellulära komponenter som frisätts från röda blodkroppar i kraftigt hemolyserade prover kan störa antigen-antikroppsreaktionen och den relativa färgmätningen i ELISA-analysen. För att förhindra hemolys är det att föredra att undvika högt undertryck i sprutan under bloduppsamling eftersom detta kan leda till att erytrocyter brister.
För det andra är det viktigt att späda ut serumproverna för att erhålla OD-värden inom den linjära delen av absorbanskurvan. Vår rekommenderade spädningsfaktor (1:100) kalibrerades utifrån den EAE-patologi som inducerades i våra musstammar. Med tanke på den inneboende heterogeniteten hos denna in vivo-modell rekommenderas det starkt att utföra preliminära titreringsexperiment för att identifiera den idealiska utspädningsfaktorn för den specifika EAE-patologi som testas. På samma sätt kan inkubationstiderna med TMB-substratet justeras för att undvika mättnad av den kromogena signalen och hålla OD-värdena inom intervallet 0-2.
För det tredje är de korrigerade OD-värdena som erhålls i detta protokoll kompatibla med en semikvantitativ analys av autoantikroppsserumtitrar mellan olika experimentella betingelser eller för kinetiska studier längs sjukdomsprogression. Om en absolut kvantifiering av autoantikroppsnivåerna behövs måste en kalibreringskurva implementeras i ELISA-designen. Flera antikroppar mot MOL-peptid är kommersiellt tillgängliga och kan användas som tillförlitliga standarder för att beräkna koncentrationen av MOG-specifika antikroppar i serum hos EAE-möss. För att fånga upp effekter av olika storleksordning rekommenderas att man inkluderar ett brett spektrum av utspädningar för den kalibrerande antikroppen (från pg/ml till μg/ml koncentrationer).
Slutligen är detta protokoll extremt flexibelt och kan enkelt anpassas för att tillgodose olika forskningsbehov. Till exempel kan den belagda encefalitogena peptiden varieras för att bedöma autoantikroppssvaret i andra EAE-paradigm. Dessutom kan olika sekundära antikroppar användas för att mäta nivåerna av olika immunglobulinklasser. För detta ändamål visade detta protokoll framgångsrikt att ataxin-1 kontrollerar både IgG- och IgM-klasser av MOG-peptidspecifika antikroppar12. Slutligen skulle man kunna tänka sig en möjlig användning för att upptäcka autoantikroppar i blodet hos MS-patienter. Det finns dock stora skillnader mellan EAE och MS-sjukdomar. Medan det förstnämnda induceras artificiellt genom att förstärka immunsvaret mot ett väldefinierat autoantigen med starka adjuvans, uppstår det senare spontant och inga entydiga autoantigener har ännu identifierats. Nya rön tyder på att molekylär härmning kan vara inblandad i virusproteiner15. Därför bör man alltid ta hänsyn till förbehåll när man direkt översätter observationer som samlats in i denna djurmodell till den mänskliga sjukdomen.
Sammanfattningsvis representerar det nuvarande protokollet ett enkelt och bekvämt alternativ till kommersiella ELISA-kit och kan effektivt kombineras med andra metoder såsom cellbaserade analyser (CBA) för exakt uppskattning av autoantikroppsfrisättning i samband med autoimmun demyelinisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna uppger att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institutes of Health (R03NS131908) och försvarsdepartementet genom Multiple Sclerosis Research Program under Award No. W81XWH-22-1-0517. Åsikter, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarens och stöds inte nödvändigtvis av försvarsdepartementet. Denna studie stöddes också av East Carolina Universitys startfonder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A.
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
