Summary
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.
Abstract
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle de maladie qui récapitule la maladie auto-immune de la sclérose en plaques (SEP) aux niveaux histopathologique et moléculaire. L’EAE est induite par l’immunisation d’animaux de laboratoire par injection sous-cutanée de peptides de myéline courts associés à des adjuvants spécifiques pour stimuler la réponse immunitaire. Comme leurs homologues humains, les souris EAE développent des lésions démyélinisantes, une infiltration de cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC), une activation gliale et des lésions neuronales. De nombreuses données probantes confirment également l’existence d’un rôle mécaniste du dysfonctionnement des lymphocytes B dans l’étiologie de la SP et de l’EAE. Les lymphocytes B peuvent servir de cellules présentatrices d’antigènes ainsi que de source primaire de cytokines pro-inflammatoires et d’auto-anticorps. Dans l’EAE, des anticorps sont générés contre les peptides de myéline qui ont été utilisés pour induire la maladie. Il a été démontré que ces auto-anticorps médient soit la perte de myéline, soit la réactivation des lymphocytes T pathogènes dans le SNC. Cet article décrit un protocole efficace basé sur l’ELISA pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris C57BL/6J immunisées avec le peptide de la glycoprotéine 35-55 de la myéline oligodendrocyte (MOG35-55). La méthode proposée constitue un outil puissant pour étudier la spécificité et l’ampleur de la réponse humorale aberrante dans le contexte de la démyélinisation auto-immune.
Introduction
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration focale de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral, une dégradation des gaines de myéline enveloppant les axones, une activation de la glie et une perte neuronale1. En plus du rôle bien établi des lymphocytes T pathogènes, de multiples éléments de preuve ont mis en évidence l’implication des lymphocytes B dans la médiation de la réponse auto-immune contre le SNC. Les lymphocytes B subissent une expansion clonale dans le cerveau de la SP et des anticorps dirigés contre les composants de la myéline ont été détectés dans les lésions démyélinisées 2,3. L’activation sélective des lymphocytes B périphériques au début de la maladie a été récemment documentée, suggérant un rôle présumé de ce compartiment cellulaire immunitaire dans l’initiation de la maladie4. Le succès des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B, telles que les anticorps monoclonaux anti-CD20, corrobore davantage le lien mécaniste entre le fonctionnement aberrant des lymphocytes B et la démyélinisation auto-immune 5,6. D’un point de vue moléculaire, les lymphocytes B peuvent contribuer à la maladie via la présentation d’auto-antigènes, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et la production d’anticorps autoréactifs.
De multiples modèles animaux ont été mis au point pour récapituler les caractéristiques spécifiques du phénotype complexe de la SP. Parmi eux, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le paradigme in vivo le plus largement utilisé et repose sur l’immunisation d’animaux de laboratoire avec des peptides courts dérivés de protéines de myéline telles que la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) et la protéine basique de la myéline (MBP)7. Les animaux immunisés contre l’EAE développent une pathologie démyélinisante qui ressemble à la SEP à bien des égards, y compris une réponse humorale robuste contre le peptide encéphalitogène8. Pour cette raison, les études EAE ont joué un rôle déterminant dans la dissection de la fonction des lymphocytes B et des auto-anticorps dans le contexte de la maladie. Par exemple, il a été démontré que les anticorps spécifiques de MOG isolés chez des patients atteints de SEP peuvent aggraver l’évolution clinique dans les modèles EAE9. Notamment, le résidu de proline à la position 42 dans le MOG humain s’est avéré essentiel pour déterminer la pathogénicité des auto-anticorps10. Plus récemment, il a été constaté que les auto-anticorps spécifiques de MOG favorisent la maladie non seulement en médiant la perte de myéline, mais aussi en stimulant la réactivation des lymphocytes T autoréactifs dans le SNC11.
Compte tenu de l’importance des réponses anticorps dans l’auto-immunité du SNC, cet article présente un protocole basé sur ELISA pour mesurer efficacement les taux sériques d’anticorps autoréactifs chez les souris C57BL/6J EAE immunisées avec le peptide MOG35-55. Dans la première partie du protocole, la méthode de prélèvement du sérum par ponction intracardiaque sera décrite. Par la suite, les procédures de mise en place du test ELISA et d’acquisition des données seront détaillées. Enfin, l’analyse et l’interprétation des données seront abordées.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des souris ont été effectuées conformément aux directives expérimentales approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline de l’Est (IACUC). Des souris femelles Wildtype C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les animaux proviennent d’une source commerciale (voir la Table des matières). L’EAE a été induite à la suite de rapports précédemment publiés 12,13,14.
1. Collection de sérum
- Euthanasier la souris expérimentale par asphyxie au CO2 ou surdose d’isoflurane au moment requis (selon les protocoles approuvés par l’établissement) après avoir induit l’EAE par l’immunisation MOG35-55.
REMARQUE : Le nombre total de souris et les points temporels pour la collecte du sérum peuvent varier en fonction de l’expérience spécifique. - Une fois que l’absence de signes vitaux est confirmée par un pincement des orteils ou de la queue, placez la souris en position de décubitus dorsal sur un plateau de dissection et fixez les membres en position avec des épingles ou du ruban adhésif. Orientez le corps de la souris sur la source lumineuse LED (voir tableau des matériaux) pour éclairer le thorax de l’animal.
- Vaporisez la fourrure de souris avec de l’éthanol à 70 % et faites une incision médiane de 3 à 4 cm le long de l’abdomen, du bassin au xiphoïde, à l’aide des ciseaux de dissecteur, en prenant soin d’éviter les organes et les principaux vaisseaux (Figure 1A-C). Pour faciliter la procédure, utilisez la pince pour saisir la peau au-dessus du processus xiphoïde.
- Coupez le diaphragme latéralement, puis coupez la cage thoracique vers l’avant sur les deux bords latéraux à l’aide des ciseaux à ressort, en vous arrêtant avant d’atteindre le sternum sur la ligne médiane (Figure 1D). Repliez le rabat de nervure créé sur la tête de la souris pour exposer le cœur (Figure 1E).
REMARQUE : Il est à éviter de couper le sternum car cela endommagerait les principales artères thoraciques adjacentes à l’os et réduirait le volume de sang pouvant être collecté. - Insérez une aiguille de 25 g reliée à une seringue de 1 mL dans le ventricule gauche et prélevez le sang en tirant doucement le piston vers l’arrière (figure 1F). Pour faciliter la ponction de l’aiguille, calez doucement le cœur contre une paire de pinces.
REMARQUE : Si le sang n’apparaît pas immédiatement dans la seringue, l’aiguille doit être tournée lentement et un angle différent doit être testé. Cependant, des efforts doivent être faits pour placer correctement l’aiguille dès la première tentative afin d’éviter de créer des trous inutiles dans le cœur où le sang peut s’échapper. - Transférez le sang dans un tube stérile de 1,5 ml et laissez-le coaguler pendant 30 minutes à température ambiante. Retirer le caillot par centrifugation à 2000 × g pendant 20 min à 4 °C. Prélever le surnageant, qui représente la fraction sérique, et stocker les aliquotes à usage unique dans des tubes cryogéniques à -80 °C pour des tests futurs.
2. Dosage ELISA
- Remettre en suspension le peptide MOG35-55 lyophilisé (voir tableau des matières) dans l’eau pour obtenir un stock de 10 mg/mL. Avant de commencer l’expérience, diluer la substance à 10 μg/mL dans un tampon de revêtement (voir le tableau des matériaux) et pipeter 100 μL/puits de la solution finale dans une plaque à 96 puits. Scellez la plaque avec un film adhésif pour éviter l’évaporation et incubez la plaque pendant la nuit à 4 °C.
REMARQUE : Au moins 2 puits doivent être calculés pour chaque échantillon et 2 puits supplémentaires doivent également être inclus pour un contrôle à blanc. - En parallèle, enduire le même nombre de puits avec 100 μL/puits d’albumine sérique bovine (BSA) dissoute dans un tampon d’enrobage à une concentration de 10 μg/mL. Ces puits supplémentaires serviront de contrôles en arrière-plan.
REMARQUE : Il est recommandé d’enduire avec BSA les puits de contrôle car les tampons de revêtement et de blocage ont des compositions différentes. Veuillez noter que d’autres peptides encéphalitogènes (tels que PLP139-151 ou MBP84-104) pourraient être utilisés comme antigènes non pertinents en alternative à la BSA. - Le lendemain, laver la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de solution saline tampon phosphatée complétée par 0,05 % de Tween 20 (PBS-T). Par la suite, ajouter 100 μL/puits d’une solution bloquante composée de 3 % de BSA dans du PBS (sans Tween 20) et incuber la plaque scellée pendant 1 h à 37 °C dans un four d’hybridation.
- Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Diluer chaque échantillon de sérum à 1:100 dans une solution bloquante et ajouter 100 μL/puits dans les puits revêtus de MOG35-55 et de BSA. Ajouter le même volume de solution de blocage dans les puits désignés comme blancs. Incuber la plaque scellée pendant 2 h à température ambiante, en agitant constamment (250 tr/min).
- Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la HRP (1:2000, voir le tableau des matériaux) dans une solution composée de 0,2 % de BSA dans du PBS-T et ajouter 100 μL/puits à tous les puits. Incuber la plaque scellée pendant 1 h à température ambiante, en agitant constamment (250 tr/min).
- Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Ajouter 100 μL/puits de substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) 3,3',5,5' (voir le tableau des matériaux) à tous les puits et incuber dans l’obscurité pendant 1 à 5 min, en surveillant le développement d’une couleur bleue.
- Arrêtez la réaction en ajoutant 100 μL/puits de solution d’arrêt (voir le tableau des matériaux) et mesurez la densité optique (DO) dans chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé à une longueur d’onde de 450 nm.
REMARQUE : Le substrat TMB doit être équilibré à température ambiante pendant 30 à 60 minutes avant de l’ajouter dans les puits.
- Arrêtez la réaction en ajoutant 100 μL/puits de solution d’arrêt (voir le tableau des matériaux) et mesurez la densité optique (DO) dans chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé à une longueur d’onde de 450 nm.
3. Analyse des données
- Remplissez une feuille de calcul Excel avec les valeurs OD lues à partir de la plaque. Faites la moyenne des valeurs de DO obtenues à partir de puits dupliqués (MOG35-55 et revêtus de BSA) pour chaque échantillon.
- Pour chaque échantillon, soustraire la valeur moyenne des puits revêtus de BSA de celle des puits revêtus de MOG35-55. Les valeurs corrigées du bruit de fond qui en résultent seront proportionnelles à la concentration d’anticorps anti-MOG35-55 dans les différents échantillons de sérum.
REMARQUE : Les puits vides doivent donner des valeurs corrigées autour de 0. - Appliquez un test statistique non paramétrique tel que le test U de Mann-Whitney pour comparer les valeurs moyennes de DO entre deux conditions expérimentales. Incluez au moins 3 échantillons indépendants pour chaque condition.
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Representative Results
Pour démontrer la robustesse du test ELISA actuel, la méthode a été testée sur des échantillons de sérum isolés d’une cohorte de souris femelles C57BL/6J à 20 jours après l’immunisation (dpi) avec 100 μg de peptide MOG35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA) selon un protocole d’induction EAE validé 12,13,14. Les animaux ont également reçu 400 ng de toxine coqueluche les jours 0 et 2. Des échantillons de sérum d’animaux immunisés simulés avec tout, mais sans le peptide, ont servi de contrôles négatifs. Toutes les souris EAE ont développé les premiers signes de la maladie entre 11 et 14 dpi et ont atteint à 20 dpi un score moyen de 2,6 ± 0,6 (erreur type, SE) sur une échelle de 0 à 6 (0, aucun signe ; 1, diminution du teint de la queue ; 2, monoparésie ou paraparésie légère ; 3, paraparésie sévère ; 4, paraplégie ; 5, quadriparésie ; et 6, moribond ou mort)12. Comme prévu, les échantillons EAE ont montré des valeurs de DO significativement plus élevées que les échantillons témoins (figure 2). Ces données confirment la présence d’une réponse immunoglobuline IgG robuste contre le peptide MOG au pic de la maladie.
Figure 1 : Procédure de ponction cardiaque. (A-E) Images représentatives de la procédure de thoracotomie pour accéder au cœur chez la souris adulte. (F) Image représentative de la procédure correcte d’insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche du cœur de la souris. Les structures anatomiques pertinentes sont indiquées dans chaque panneau pour faciliter la dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Auto-anticorps peptidique MOG ELISA. Les taux sériques d’immunoglobulines IgG anti-MOG35-55 ont été testés chez des souris EAE et des souris immunisées simulées 20 jours après l’immunisation (dpi) à l’aide du protocole ELISA rapporté. Des valeurs de DO systématiquement plus élevées ont été détectées dans les échantillons EAE par rapport aux témoins. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET (N = 3 par groupe). Les différences entre les groupes ont été évaluées par le test unilatéral U de Mann-Whitney, *P ≤ 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, un protocole simple et efficace basé sur l’ELISA a été rapporté pour quantifier avec précision la réponse humorale dans un modèle animal pertinent de la pathologie de la SEP. Cette méthode a récemment été utilisée pour décrire le nouveau rôle de la protéine ataxine-1 dans le contrôle des taux sériques d’auto-anticorps dans le paradigme MOG35-55/C57BL6J EAE12. À cet égard, un certain nombre de facteurs doivent être pris en considération afin d’obtenir des résultats cohérents et biologiquement significatifs avec cette méthode.
Tout d’abord, il est crucial de collecter des échantillons de sérum de haute qualité et d’éviter l’hémolyse. L’hémoglobine et d’autres composants intracellulaires libérés par les globules rouges dans les échantillons fortement hémolysés peuvent interférer avec la réaction antigène-anticorps et la mesure de la couleur relative dans le test ELISA. Pour éviter l’hémolyse, il est préférable d’éviter une pression négative élevée dans la seringue lors du prélèvement sanguin, car cela peut provoquer une rupture des érythrocytes.
Deuxièmement, il est important de diluer les échantillons de sérum pour obtenir des valeurs de DO dans la partie linéaire de la courbe d’absorbance. Notre facteur de dilution recommandé (1:100) a été calibré sur l’entité de la pathologie EAE induite dans nos souches de souris. Compte tenu du niveau intrinsèque d’hétérogénéité de ce modèle in vivo , il est fortement recommandé d’effectuer des expériences de titrage préliminaires afin d’identifier le facteur de dilution idéal pour la pathologie spécifique de l’EAE testée. De même, les temps d’incubation avec le substrat TMB peuvent être ajustés pour éviter la saturation du signal chromogène et maintenir les valeurs de DO dans la plage 0-2.
Troisièmement, les valeurs corrigées de DO obtenues dans ce protocole sont compatibles avec une analyse semi-quantitative des titres sériques d’auto-anticorps entre différentes conditions expérimentales ou pour des études cinétiques le long de la progression de la maladie. Si une quantification absolue des niveaux d’auto-anticorps est nécessaire, une courbe d’étalonnage doit être mise en œuvre dans la conception ELISA. De multiples anticorps contre le peptide MOG sont disponibles dans le commerce et peuvent être utilisés comme étalons fiables pour calculer la concentration d’anticorps spécifiques du MOG dans le sérum des souris EAE. Pour saisir des effets de différentes amplitudes, il est recommandé d’inclure une large gamme de dilutions pour l’anticorps d’étalonnage (allant de pg/mL à des concentrations de μg/mL).
Enfin, ce protocole est extrêmement flexible et peut être facilement adapté pour répondre aux différents besoins de recherche. Par exemple, le peptide encéphalitogène enrobé peut être modifié pour évaluer la réponse auto-anticorps dans d’autres paradigmes EAE. De plus, différents anticorps secondaires peuvent être utilisés pour mesurer les niveaux de différentes classes d’immunoglobulines. À cette fin, ce protocole a démontré avec succès que l’ataxine-1 contrôle à la fois les classes IgG et IgM des anticorps spécifiques du peptide MOG12. Enfin, on pourrait envisager une utilisation possible pour détecter les auto-anticorps dans le sang des patients atteints de SEP. Cependant, il existe des différences substantielles entre l’EAE et la SEP. Alors que le premier est induit artificiellement en stimulant la réponse immunitaire contre un auto-antigène bien défini avec de puissants adjuvants, le second apparaît spontanément et aucun auto-antigène sans ambiguïté n’a encore été identifié. Des preuves récentes suggèrent l’implication possible du mimétisme moléculaire avec des protéines virales15. Par conséquent, les mises en garde doivent toujours être prises en compte dans l’application directe des observations recueillies dans ce modèle animal à la maladie humaine.
En résumé, le protocole actuel représente une alternative facile et pratique aux kits ELISA commerciaux et pourrait être efficacement combiné avec d’autres méthodes telles que les tests cellulaires (CBA) pour l’estimation précise de la libération d’auto-anticorps dans le contexte de la démyélinisation auto-immune.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (R03NS131908) et le ministère de la Défense par le biais du programme de recherche sur la sclérose en plaques sous le numéro de bourse W81XWH-22-1-0517. Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Cette étude a également été soutenue par des fonds de démarrage de l’Université de Caroline de l’Est.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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