Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Summary

Bu protokol bir konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri Fotoçevrim gerçekleştirmek için genel bir yaklaşım açıklar. Biz Fotoçevrim puried protein örneklerinin yanı sıra, mOrange2 ve Dronpa canlı hücreleri çift prob, optik vurgulama için prosedürler açıklanmaktadır.

Abstract

Photoconvertible floresan proteinleri (pc-FP) floresan renk, belirli bir dalga boyunda ışığa maruz tarafından değiştirilebilir anlamına gelir "optik işaretleme" özelliğine sahip bir sınıf, floresan proteinleri. Optik vurgulayarak, noninvaziv bir ICSI'nin floresan moleküllerin işaretlenmesi sağlar ve bu nedenle tek hücreler veya organeller izlemek için idealdir.

Verimli Fotoçevrim için kritik parametreleri Fotoçevrim ışık şiddeti ve maruz kalma süresi. Yoğunluğu çok düşükse, Fotoçevrim yavaş ya da hiç ortaya olacaktır. Öte yandan, çok fazla yoğunluk ya da çok uzun süre maruz kaldıklarından protein photobleach ve böylece Fotoçevrim etkinliğini azaltmak.

Bu protokol, pc-FP Fotoçevrim uygulamalar için bir konfokal lazer tarama mikroskobu nasıl kurmak için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. İlk olarak, saflaştırılmış protein damlacık numunelerin hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu örnek biçimi mikroskop altında floresan proteinleri photophysical davranış eğitimi için çok uygundur. İkincisi, biz Fotoçevrim için mikroskop nasıl yapılandırılacağı göstermek için protein damlacık örnek kullanabilirsiniz. Ve nihayet, mOrange2 ve Dronpa çift prob, optik vurgulayarak dahil olmak üzere, canlı hücreleri, optik vurgulama nasıl gerçekleştirileceği gösterecektir.

Protocol

1. Floresan protein damlacık numunelerin hazırlanması

Bir floresan protein damlacık örnek su aşamasında bulunan floresan protein ile 1-octanol/water emülsiyon oluşur. Bu emülsiyon mikroskopi uygulamaları için bir mikroskop lamı ve 22 mm kare cam kapak arasında sıkışmış.

1. Floresan protein damlacık örnekleri yapmadan önce mikroskop slayt ve kapak camları hidrofobik bir ajan ile temizlenmeli ve kaplanmış olması gerekir.
2. Cam, aseton ile 5 dakika yıkayarak temizleyin ve hava ile kurumaya bırakın. (İsteğe bağlı olarak, cam temizlendikten sonra plazma temiz optimal kaplama sonuçları elde etmek için 30 saniye boyunca tedavi edilebilir).
3. Bu çözüm bir 2 dakika inkübasyon sırasında, aseton ve kat cam% 2 methyltrimethoxysilane çözüm hazırlayın. Çözüm cam kaplama sonra çıkarın ve hava ile kurumaya bırakın. Sonra bir sprey şişesine% 70 etanol ile yıkayın ve tekrar kurumaya bırakın. (İsteğe bağlı olarak, bu noktada cam ° C kovalent cam kaplama bağlamak için 1 saat 80 pişmiş olabilir). Kaplamalı cam, en az bir ay süreyle saklanabilir.
4. Floresan proteinlerle E. Onun ₆ etiketli protein olarak saflaştırılmış. Coli ^1. Saflaştırılmış protein absorbans spektrumu ölçün ve STE tampon (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH: 8, 1 mM EDTA) ~ 0.1 optik yoğunluk ile stok seyreltme hazırlamak,% 0.1 sığır serum albümin içeren (BSA) . Buna ek olarak 10 ml 15 ml konik bir tüp içerisinde 1-oktanol ve STE tampon 1:1 karışımı hazırlar ve şiddetle karıştırın. Karıştırma terk ettikten sonra, faz ayrılması tamamlanana kadar. Üst faz 1-oktanol. (Dikkat: 1-oktanol güçlü bir kokusu vardır Çünkü 1-oktanol ile temas gelir her şey için kapalı bir atık kabı kullanmak önemlidir.)
5. Emülsiyon pipet 45 ul 1-oktanol ve bir mikrofuge'de tüp içinde 5 ul floresan protein yapmak için. Emülsiyon oluşumunu başlatmak ve sonra sonication banyosunda 30 saniye boyunca tüp sonikasyon parmağınızla birkaç kez tüp dokunun. Bu arada kaplı bir mikroskop lamı ve kapak cam hazır. Sonication sonra emülsiyon tamamen bulutlu olmalıdır. Kaplamalı bir mikroskop lamı üzerine tüp orta sonikasyon pipet 4 ul emülsiyon hemen sonra kaplı bir cam kapak ile kaplayın.
6. Emülsiyon işlemi yapılırsa doğru mikroskop slayt ve nesne cam arasında eşit olarak yaymak gerekir. Birkaç dakika içinde örnek çapı değişen ~ 10 mikron kalınlığında floresan damlacıkları oluşan kararlı olmalıdır. Büyük damlacıkları örnek merkezine yakın ve küçük kenarlara doğru daha da bulunmaktadır.

2. Bir Fotoçevrim deneme ayarlama

Aşağıdaki yordam, bir floresan protein Fotoçevrim deney kurmak için genel bir strateji. Bu prosedür, canlı hücrelerin yanı sıra proteinler saflaştırılmış için uygulanabilir.

1. Aşağıdaki parametreler Fotoçevrim denemeyi ayarlamak için genel bir başlangıç ​​noktası sağlar:
   40x 1.3NA immersiyon yağı hedefi
   Görüntü boyutu = 512 x 512 piksel
   Tarama zum = 4
   
   Piksel süresi = 6 μsec yaşamak.
   Z-çözünürlüklü (iğne deliği boyutu) = 3 mikron
2. Ilk ve photoconverted floresan için iki algılama kanal, yanı sıra bir "Fotoçevrim kanalı" yapılandırın. Bu örnekte, saflaştırılmış bir turuncu-kırmızı photoconvertible floresan protein protein, mOrange2 kullanabilirsiniz. 561 nm eksitasyon ve floresan 570 nm ve 630 nm arasında toplanan turuncu türler kullanılarak tespit edilmiştir. Photoconverted kırmızı türler 633 nm eksitasyon ve floresan 640 nm ve 700 nm arasında toplanan kullanarak tespit edilmiştir. "Fotoçevrim kanal" 488 nm eksitasyon ve 490 nm ve 540 nm arasında floresan toplamak için. (Not: Fotoçevrim kanal görüntüleme kesinlikle gerekli değildir)
3. Lazer gücü ve en iyi görüntü kalitesi için dedektör kazancı ayarlamak için sürekli tarama ile ilk floresan görüntüleme için kanal kullanın.
4. Fotoçevrim kanal etkinleştirin ve düşük bir lazer güç seçin. Görüntüleme başlayın ve zaman atlamalı serisi ilk floresan beyazlatma önemli görülünceye kadar yavaş yavaş Fotoçevrim lazer artırmak. Yaklaşık% 75'i ilk floresan beyazlatılmış kadar tarama devam edin.
5. Fotoçevrim kanalı kapatmak ve photoconverted floresan için algılama kanalı etkinleştirmek. Görüntüleme, yüksek bir dedektör kazanç ve düşük lazer gücü ile başlatın ve photoconverted floresan tespit edilinceye kadar, kademeli olarak lazer gücünü artırmak. Bir kere, lazer gücü ve en iyi görüntü kalitesi için dedektör kazanç ayarlayabilirsiniz photoconverted floresan algılar.
6. Son olarak, lazer güç kullanılırFotoçevrim süresi Fotoçevrim gibi iyi optimize edilmesi gerekir. Fotoçevrim oranı hızlandırmak Fotoçevrim lazer gücü artırılması, ancak çok fazla lazer güç protein photobleach.
7. Optimal Fotoçevrim lazer gücü ve süresi, tespit edildikten sonra, bu parametrelerin standart bir photobleaching veya sıkı bağlamak modülü ve "Fotoçevrim kanalı" gerekli artık yapılandırmak için kullanılabilir.

3. MOrange2 ve Dronpa Dual-optik prob vurgulama

Çünkü kırmızı-kaymıştır spektral özellikleri, mOrange2 4 ayrı hücre (organel) popülasyonları seçici vurgulayarak izin çift prob optik vurgulamak için yeşil photoswitchable floresan protein Dronpa ile kombinasyon halinde kullanıldığında olabilir.

1. Hücreler cam alt Mattek yemekler büyüdü ve standart Lipofectamine2000 transfeksiyon ¹ kullanarak görüntüleme önce 24 saat transfekte.
2. 2 numaralı bölümde açıklandığı gibi mOrange2 Fotoçevrim mikroskop ayarlayın.
3. Dronpa photoswitching mikroskop yapılandırın. Dronpa floresan mOrange2 "Fotoçevrim kanalı" (adım 2.2 'e bakınız) kullanarak görüntülü olabilir. (Not: görüntüleme Dronpa için kullanılan lazer gücü en aza indirin, çünkü çok fazla lazer gücü Dronpa inaktivasyonu neden olacaktır.) Dronpa fotoaktivasyon için bir kanal ekleyin. Biz iki foton uyarma 800 nm fotoaktivasyon için kullanır, ama alternatif olarak 405 nm eksitasyon kullanılarak elde edilebilir. Lazer görüntüleme için gerekli güç, fotoaktivasyonu ve Dronpa floresan photoinactivation belirleyin.
4. Dikkat: mOrange2, Fotoçevrim ve Dronpa inaktivasyonu hem de 488 nm uyarma üzerine ortaya çıkar. Çünkü mOrange2 Fotoçevrim için gerekli yüksek lazer gücü bu da Dronpa floresan inaktive edecek. Öte yandan, Dronpa inaktivasyon zaten, çok daha düşük lazer güç oluşur ve önemli mOrange2 Fotoçevrim olmadan yapılabilir.
5. MOrange2 Fotoçevrim ve Dronpa photoswitching için parametreleri ayarladıktan sonra, çift optik prob vurgulayarak aşağıdaki adımları ile elde edilir. Birincisi, düşük güç 488 nm eksitasyon manzaralı tüm alanında Dronpa floresan inaktive. İkinci olarak, faiz ve yüksek güç 488 nm eksitasyon ile photoconvert mOrange2 bir bölge seçin. Son olarak, faiz Dronpa floresan etkinleştirmek için bir bölge seçin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Damlacık numune hazırlama A) Doğru hazırlanmış bir damlacık örnek . B) Örnek mikroskop slayt ve kapak cam kaplama olmadan hazırlanmış. C)% 0,1 BSA eklemeden örnek hazırlanmıştır.

Şekil 2. MOrange2 Fotoçevrim Fotoçevrim lazer gücü ve süresi Etkisi Tek damlacıkları mOrange2 protein içeren sürekli farklı miktarlarda 488 nm lazer güç kullanarak photoconverted. Fotoçevrim için kullanılan Bağıl lazer gücü% 10 (katı),% 25 (kesikli), ve% 100 (noktalı) oldu. A) Portakal floresan türler. B) Photoconverted kırmızı floresan türü.

Şekil 3. MOrange2 ve Dronpa Dual-optik prob vurgulayarak mitokondri çekirdeği ve yeşil floresan turuncu floresan gösteren Fotoçevrim önce mOrange2 Histon H2B ve Dronpa-Mito ifade A) Hücre,. B) Dronpa floresan mOrange2 minimal Fotoçevrim neden, düşük güç 488 nm eksitasyon ile kapalı idi. C) yüksek güç 488 nm eksitasyon mOrange2 kırmızı photoconverted. D) Dronpa floresan 800 nm 2-foton uyarma tekrar kullanarak açık. Diferansiyel girişim kontrastlı görüntü panelleri ile birlikte floresan görüntü bindirmeleri.

Discussion

Saflaştırılmış floresan protein damlacık örnek kinetik ve Fotoçevrim kinetiği photobleaching çalışma örneğin, floresan proteinleri photophysical karakterizasyonu için çok uygun bir örnek biçimidir. Photobleaching ve küvet tabanlı sistemler gerçekleştirmek için zor olabilir Fotoçevrim deneyler, son derece küçük damlacık hacmi (~ 20 picolitre) kolaylaştırır. Buna ek olarak, damlacık örnek ideal Fotoçevrim uygulamalar için bir konfokal mikroskop kurmak için uygundur burada gösterilir. Hidrofobik kaplama ve BSA varlığı homojen damlacıkları elde etmek için önemlidir. Kaplama olmadan damlacıkları cam yüzeylerin birine karşı sıkıştırılmış olma eğilimindedir ve BSA yokluğunda floresan protein floresans (Şekil 1) bir hale oluşturarak, 1-octanol/water arayüzü birikme eğilimindedir.

Floresan protein Fotoçevrim sık sık, bir de photoconverted türler takip edebilirsiniz avantajı ile, floresan photobleaching sonra kurtarma (sıkı bağlamak) için bir alternatif olarak kabul edilir. Ancak, bu Fotoçevrim kullanılan lazer gücü kritik bağımlı olduğunu dikkate almak önemlidir. Çok fazla Fotoçevrim lazer güç ya da çok uzun pozlama böylece photoconverted floresan miktarını azaltarak (Şekil 2), yerine Fotoçevrim daha photobleaching neden olacaktır.

MOrange2 ve photoconverted türler kırmızı-kaymıştır spektral özellikleri yeşil flüoresan optik işaretleme ile çift prob, optik vurgulayarak izin verir. Bu da, burada gösterildiği gibi bir photoswitchable floresan protein (Dronpa), ya da örneğin PA-GFP için alternatif bir photoactivatable floresan protein, olabilir. Dronpa bir deney başında varlığını kontrol edebilirsiniz avantajı vardır. Öte yandan, Dronpa kullanımı tüm Dronpa floresan ilk inaktive olması nedeniyle, optik vurgulayarak karmaşıklaştırır ve Dronpa floresan görüntüleme sırasında yavaş yavaş kapalı olduğu bir gerçektir. Bu komplikasyonlar PA-GFP kullanırken daha az derin, ama fotoaktivasyon önce PA-GFP varlığı için kontrol etmek daha zor olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microsope slides	VWR international	48312-003
22 mm cover glass	Corning	2940-245
1-octanol	Sigma-Aldrich	O4500
methyltrimethoxysilane	Sigma-Aldrich	M6420
MatTek dishes	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019