Overview
Makalede, zebra balığı embriyolarını doğal çiftleşme ve gelişim aşamalarını sıralama yoluyla üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, transgenik balıklar kullanılarak pankreas β hücrelerinin analizi için daha fazla kullanılır.
Protocol
1. Doğal çiftleşme yoluyla embriyo üretmek
- 3 aylık kültür embriyoları, üreme olgunluğu.
- Yetişkin erkek ve dişi balıkları embriyo toplamadan önceki akşam istenen suştan bölünmüş çiftleşme tanklarına ayırın ve her tanka 2 erkek ve 3 dişi ekleyin.
NOT: Transgenik insülin kullanımı2a:mCherry floresan muhabir suşu pankreas β hücrelerinin analizine izin verdi. - Balıkları tatlı sistem suyu ile çiftleşme tankına aktarın ve ertesi sabah ışıklar yandıktan hemen sonra bölücüyü çıkarın.
- Alt tankta embriyolar gözlemlenene kadar balıkların doğal olarak çiftleşmelerini izin verin. İstenilen miktar toplanana kadar embriyoları 30 dakika aralıklarla toplayın. Toplanan her zaman noktasını 28,5 °C'de embriyo ortamlarında ayrı Petri kaplarında saklayın.
- İstenirse genetik materyalin mikroenjeksiyonunun veya deneysel kültür ortamlarına yerleştirilmesini gerçekleştirin ve taze Hank'in embriyo ortamındaki embriyoları 28,5 °C'de 10 cm Petri kaplarında kültüre edin.
NOT: Morfotin (MO) enjekte edilen veya mutant hayvanlarda gen ekspresyolojisi analizi için, her manipülasyonun gen ekspresyolojisi üzerinde tesadüfi etkileri olabileceğini unutmayın. Mutantlar, MO tabanlı gen hedeflemesi ile gözlenmeyen transkripsiyon seviyesinde genetik kompanzasyon sergileyebilirler.
2. Evre embriyolar
- Tüm embriyoların tutarlı gelişimsel zamanlamasını teşvik etmek için embriyoları 10 cm Petri kabı başına 50-75 embriyo grubunda kültürleyin.
- Gelişimsel ilerlemeyi sağlamak için blastomere, epiboly ve somit aşamalarında diseksiyon mikroskobu kullanarak gelişim morfolojisini izleyin.
NOT: Çanaktaki gelişimsel gecikmeyi önlemek için ölen veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları çıkarın. - Embriyoları gelişim yaşına göre ayırın. Embriyoları ve larvaları 24 hpf'den sonra toplam vücut uzunluğunu kullanarak düzenleyin.
NOT: Somitler embriyonun dorsal kısmında bulunan köşeli çift ayraç şeklindeki mezodermal dokudur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss |
