Paarung und Eierinszenierung: Eine Methode, um Embryonen zu generieren und sie nach Entwicklungsstadium zu sortieren

Overview

Der Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zebrafischembryonen durch natürliche Paarung und Sortierung ihrer Entwicklungsstadien. Das Protokoll wird weiter für die Analyse von Bauchspeicheldrüsen-β-Zellen unter Verwendung transgener Fische verwendet.

Protocol

1. Erzeugung von Embryonen durch natürliche Paarung

1. Kultur Embryonen bis 3 Monate Alter, reproduktive Reife.
2. Trennen Sie erwachsene männliche und weibliche Fische von der gewünschten Sorte in geteilte Paarungstanks am Abend vor der Embryo-Sammlung, und fügen Sie 2 Männchen und 3 Weibchen zu jedem Tank hinzu.
   ANMERKUNG: Die Verwendung des transgenen Insulin2a:mCherry fluoreszierenden Reporterstamms ermöglichte die Analyse der Bauchspeicheldrüsen-β-Zellen.
3. Den Fisch mit frischem Systemwasser in den Stecktank geben und den Teiler sofort entfernen, nachdem die Lichter am nächsten Morgen eingeschaltet sind.
4. Lassen Sie die Fische natürlich paaren, bis Embryonen im Bodentank beobachtet werden. Sammeln Sie Embryonen in 30 min Abständen, bis die gewünschte Menge gesammelt wird. Bewahren Sie jeden gesammelten Zeitpunkt in separaten Petrischalen in Embryomedien bei 28,5 °C auf.
5. Mikroinjektion von genetischem Material oder Platzierung in experimentellen Kulturmedien, falls gewünscht, und Kultur der Embryonen in frischem Hank-Embryo-Medium in 10-cm-Petrischalen bei 28,5 °C.
   ANMERKUNG: Beachten Sie bei der Genexpressionsanalyse bei Morpholino (MO) injizierten oder mutierten Tieren, dass jede Manipulation zufällige Auswirkungen auf die Genexpression haben kann. Mutanten können eine genetische Kompensation auf der Ebene der Transkription aufweisen, die nicht durch MO-basiertes Gen-Targeting beobachtet wird.

2. Stadium Embryonen

1. Kultur die Embryonen in Gruppen von 50-75 Embryonen pro 10-cm Petrischale, um eine konsistente Entwicklungszeit für alle Embryonen zu fördern.
2. Überwachen Sie die Entwicklungsmorphologie mit dem Sezieren von Mikroskopen in Blastomer-, Epiboly- und Somite-Stadien, um die Entwicklungsprogression zu gewährleisten.
   ANMERKUNG: Entfernen Sie alle sterbenden oder missgebildeten Embryonen, um Entwicklungsverzögerungen in der Schale zu verhindern.
3. Trennen Sie die Embryonen basierend auf dem Entwicklungsalter. Inszenieren Sie die Embryonen und Larven mit Gesamtkörperlänge nach 24 hpf.
   ANMERKUNG: Bei den Soden handelt es sich um das chevronförmige mesodermale Gewebe, das auf dem dorsalen Teil des Embryos vorhanden ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss