Parring og eggoppsamling: En metode for å generere embryoer og sortere dem etter utviklingsstadium

Overview

Artikkelen beskriver en protokoll for å generere sebrafiskembryoer gjennom naturlig parring og sortering av utviklingsstadier. Protokollen brukes videre til analyse av bukspyttkjertelen β celler ved hjelp av transgene fisk.

Protocol

1. Generere embryoer gjennom naturlig parring

1. Kultur embryoer til 3 måneder, reproduktiv modenhet.
2. Segregate voksen mannlig og kvinnelig fisk fra ønsket stamme i delte parringstanker på kvelden før embryooppsamling, og legg til 2 menn og 3 kvinner til hver tank.
   MERK:Bruk av den transgene insulin2a:mCherry fluorescerende reporterstammen tillot analyse av bukspyttkjertel β celler.
3. Overfør fisk til parringstanken med ferskvann og fjern skillelinjen umiddelbart etter at lysene kommer neste morgen.
4. La fisken parre seg naturlig til embryoer observeres i bunntanken. Samle embryoer i 30 minutter intervaller til ønsket mengde er samlet inn. Oppbevar hvert innsamlede tidspunkt i separate Petri-retter i embryomedier ved 28,5 °C.
5. Utfør mikroinjeksjon av genetisk materiale eller plassering i eksperimentelle kulturmedier, om ønskelig, og kultur embryoene i fersk Hanks embryomedium i 10 cm Petri-retter ved 28,5 °C.
   MERK:For genuttrykksanalyse hos morfiolin (MO) injiserte eller mutante dyr, vær oppmerksom på at hver manipulasjon kan ha tilfeldige konsekvenser for genuttrykk. Mutanter kan utvise genetisk kompensasjon på transkripsjonsnivå som ikke observeres av MO-basert genmålretting.

2. Stadium embryoer

1. Kultur embryoene i grupper på 50-75 embryoer per 10 cm Petri-tallerken for å fremme konsistent utviklingstid for alle embryoer.
2. Overvåk utviklingsmorfologien ved hjelp av dissekering av mikroskop ved blastomer, epiboly og somite stadier for å sikre utviklingsprogresjon.
   MERK:Fjern eventuelle døende eller misformede embryoer for å forhindre utviklingsforsinkelse i parabolen.
3. Skill embryoene basert på utviklingsalderen. Stadium embryoer og larver ved hjelp av total kroppslengde etter 24 HPF.
   MERK:Somittene er det chevronformede mesodermale vevet som finnes på den dorsale delen av embryoet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss