Mise en scène de l’accouplement et des ovules : une méthode pour générer des embryons et les trier au stade du développement

Overview

L’article décrit un protocole pour générer des embryons de poisson zèbre par l’accouplement naturel et le tri de leurs stades de développement. Le protocole est utilisé davantage pour l’analyse des cellules β en utilisant des poissons transgéniques.

Protocol

1. Générer des embryons par accouplement naturel

1. Embryons de culture jusqu’à l’âge de 3 mois, maturité reproductive.
2. Séparer les poissons mâles et femelles adultes de la souche désirée en réservoirs d’accouplement divisés le soir précédant la collecte des embryons, et ajouter 2 mâles et 3 femelles à chaque réservoir.
   REMARQUE: L’utilisation de la souche transgénique insulin2a:mCherry fluorescente reporter a permis l’analyse des cellules β pancréas.
3. Transférez le poisson dans le réservoir d’accouplement avec de l’eau du système frais et retirez le séparateur immédiatement après que les lumières se sont allumées le lendemain matin.
4. Laissez le poisson s’accoupler naturellement jusqu’à ce que les embryons soient observés dans le réservoir inférieur. Recueillir les embryons en intervalles de 30 minutes jusqu’à ce que la quantité désirée soit recueillie. Conserver chaque point de temps recueilli dans des boîtes de Pétri séparées dans des supports embryonnaires à 28,5 °C.
5. Effectuez la microinjection du matériel génétique ou le placement dans les médias de culture expérimentale, si désiré, et la culture des embryons dans le milieu embryonnaire frais de Hank dans des boîtes de Pétri de 10 cm à 28.5 °C.
   REMARQUE: Pour l’analyse de l’expression génétique chez les animaux injectés ou mutants par morpholino (MO), notez que chaque manipulation peut avoir des impacts accessoires sur l’expression des gènes. Les mutants peuvent présenter une compensation génétique au niveau de transcription qui n’est pas observé par le ciblage génétique basé sur le MO.

2. Embryons de stade

1. Culture des embryons en groupes de 50 à 75 embryons par boîte de Pétri de 10 cm afin de promouvoir un calendrier de développement constant de tous les embryons.
2. Surveillez la morphologie du développement à l’aide d’un microscope disséquant aux stades blastomere, épicorps et somite pour assurer la progression du développement.
   REMARQUE: Enlevez les embryons mourants ou malformés pour éviter le retard de développement dans le plat.
3. Séparer les embryons en fonction de l’âge de développement. Mettre en scène les embryons et les larves en utilisant la longueur totale du corps après 24 hpf.
   REMARQUE: Les somites sont le tissu mésodermique en forme de chevron présent sur la partie dorsale de l’embryon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss