Parning och ägg iscensättning: En metod för att generera embryon och sortera dem efter utvecklingsstadium

Overview

Artikeln beskriver ett protokoll för att generera zebrafiskembryon genom naturlig parning och sortering av deras utvecklingsstadier. Protokollet används vidare för analys av bukspottskörtelceller β med hjälp av transgena fiskar.

Protocol

1. Generera embryon genom naturlig parning

1. Kulturembryon till 3 månaders ålder, reproduktiv mognad.
2. Segregera vuxna manliga och kvinnliga fiskar från önskad stam i uppdelade parningstankar på kvällen före embryosamling och tillsätt 2 män och 3 honor till varje tank.
   OBS:Användning av den transgena insulin2a:mCherry fluorescerande reporter stam tillät analys av bukspottskörteln β-celler.
3. Överför fisk till parningstanken med färskt systemvatten och ta bort avdelaren omedelbart efter att lamporna tänds följande morgon.
4. Låt fisken para sig naturligt tills embryon observeras i bottentanken. Samla embryon i 30 minuters intervall tills önskad mängd samlas in. Förvara varje samlad tidspunkt i separata petriskålar i embryomedia vid 28,5 °C.
5. Utför mikroinjektion av genetiskt material eller placering i experimentella odlingsmedier, om så önskas, och odla embryona i färskt Hanks embryomedium i 10 cm Petri-rätter vid 28,5 °C.
   OBS:För genuttrycksanalys hos injicerade eller muterade djur med morpholino (MO) kan varje manipulering ha tillfälliga effekter på genuttrycket. Mutanter kan uppvisa genetisk kompensation på transkriptionsnivå som inte observeras av MO-baserad geninriktning.

2. Embryon i etapper

1. Kultur embryona i grupper om 50–75 embryon per 10 cm Petri-maträtt för att främja konsekvent utvecklingstidpunkt för alla embryon.
2. Övervaka utvecklingsmorfologin med hjälp av dissekerande mikroskop vid blastomere- och somitstadier för att säkerställa utvecklingsprogression.
   OBS:Ta bort döende eller missbildade embryon för att förhindra utvecklingsfördröjning i skålen.
3. Separera embryona baserat på utvecklingsåldern. Arrangera embryona och larverna med hjälp av total kroppslängd efter 24 hkf.
   OBS:Somiterna är den chevronformade mesodermala vävnaden som finns på embryots dorsala del.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss