Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio
Summary
Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas miocardio<em> In vivo</em> Se describen.
Abstract
Este protocolo proporciona los métodos para la preparación de un inyectable de la matriz extracelular (ECM) de gel para el infarto de aplicaciones de ingeniería de tejidos. En pocas palabras, el tejido descelularizada es liofilizada, se muele, se digiere enzimáticamente, y luego llevados a un pH fisiológico. La liofilización elimina todo el contenido de agua de los tejidos, dando lugar a ECM seco que puede ser molido en un polvo fino con un pequeño molino. Después de la molienda, el polvo de ECM es digerido con pepsina para formar una matriz de inyectables. Después del ajuste a un pH de 7.4, el material de la matriz líquida se puede inyectar en el miocardio. Los resultados de los ensayos de caracterización previos han mostrado que los geles matriz obtenida a partir de tejido de miocardio y pericardio descelularizada retener los componentes nativos ECM, incluyendo diversas proteínas, péptidos y glicosaminoglicanos. Dado el uso de este material para la ingeniería de tejidos, en la caracterización in vivo es especialmente útil, aquí, un método para realizar una inyección intramural en el ventrículo izquierdo (VI) de la pared libre se presenta como una forma de analizar la respuesta del huésped a la matriz de gel en un modelo de animal pequeño. El acceso a la cavidad torácica se obtiene a través del diafragma y la inyección se hace un poco por encima del vértice de la pared libre del VI. El origen biológico andamio puede ser visualizado por biotina-etiquetado antes de la inyección y luego teñir secciones de tejido con rábano picante y conjugado con peroxidasa neutravidin y visualización mediante diaminobencidina (DAB) tinción. Análisis de la región de inyección también se puede hacer con la tinción histológica e inmunohistoquímica. De esta manera, los geles de la matriz ya examinada pericardio y miocardio, se mostró a formar redes de fibra, porosa y promover la formación de vasos en la región de la inyección.
Protocol
Discussion
Este método permite la generación de origen biológico, andamios inyectables para la ingeniería de tejido miocárdico. Aunque estos métodos fueron desarrollados inicialmente para la fabricación y las pruebas in vivo de una matriz de gel de miocardio y que aquí se presenta con una matriz de gel pericárdico, este protocolo puede ser adaptado para su uso con cualquier tejido, siempre que el tejido puede ser apropiada descelularizada. Descelularización se debe realizar y verificados antes de la uti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada en parte por el nuevo director de los NIH Programa Premio a la Innovación, que forma parte de la hoja de ruta del NIH para la investigación médica, a través de la subvención número 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. agradecer a la NSF para una Beca de Investigación de Tesis.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents: | ||||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized | |
| Biotin | Thermo Scientific | 21217 | ||
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | ||
| Equipment: | ||||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | ||
| Labconco Lyophilizer | Labconco, Inc | 7670520 | ||
| Surgical supplies: | ||||
| Betadine | Purdue Products, L.P. | 67618-154-16 | ||
| Lactated Ringers Solution | MWI | 003966 | ||
| KY Jelly | MWI | 28658 | ||
| Lidocaine, 2% | MWI | 17767 | ||
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | 12496-0757-1 | ||
| Artificial tear ointment | Fisher | NC9860843 | ||
| Triple antibiotic ointment | Fisher | 19082795 | ||
| Isoflurane | MWI | 60307-120-25 | ||
| Otoscope | MWI | 008699 | ||
| Stop cock | MWI | 006245 | ||
| 3-0 Vicrile suture | MWI | J327H | ||
| 5-0 Proline suture | MWI | s-1173 | ||
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon | 8684G | ||
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | ||
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | ||
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | ||
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | ||
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | ||
| PE160 suction tubing | BD | 427430 | ||
| Clippers | MWI | 21608 | ||
| Skin staples/stapler | Ethicon | PRR35 | ||
| General supplies: | ||||
| Stir plates | ||||
| 0.1 M HCl | ||||
| 1 M NaOH | ||||
| 10x PBS | ||||
| 1x PBS | ||||
| 70% Ethanol | ||||
| 0.1 mL syringes | ||||
| 10 mL syringe | ||||
| Q-tips | ||||
| Surgical glue | ||||
| Surgical drape | ||||
| Towel clamps | ||||
| Small hand-held vacuum |
Referências
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