Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Abstract

חלבון קינאז Cs (PKCS) הם סרין קינאזות תראונין כי תפקיד מרכזי בוויסות מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון צמיחת תאים למידה וזיכרון. ישנן ארבע משפחות הידועים של isoforms PKC בבעלי חוליות: PKCS קלאסית (α, βI, βII ו γ), סוג הרומן אני PKCS (ε ו η), רומן מסוג II PKCS (δ ו θ), ו PKCS טיפוסיות (ζ ו ι ). PKCS קלאסית מופעלים על ידי Ca ^{2 +} ו diacylclycerol (דאג), בעוד PKCS רומן מופעלים על ידי DAG, אבל הם Ca ^{2 +} עצמאית. PKCS טיפוסיות מופעלים על ידי לא Ca ^{2 +} וגם לא דאג. ב Aplysia californica, מערכת המודל שלנו ללמוד היווצרות הזיכרון, ישנם שלושה ספציפיים מערכת העצבים isoforms PKC אחד מתוך כל שיעור גדול, כלומר קונבנציונלי PKC Apl אני, סוג הרומן אני PKC Apl השנייה טיפוסיות PKC Apl III. PKCS הם שומנים בדם מופעל קינאזות ובכך ההפעלה של PKCS קלאסית רומן בתגובה לאותות תאיים כבר בקורלציה לעתים קרובות עם טרנסלוקציה PKC מן הציטופלסמה אל קרום התא. לכן, טרנסלוקציה PKC חזותי בזמן אמת בתאים חיים הפך להיות כלי רב ערך עבור הבהרת הולכת אותות מסלולים שיובילו הפעלת PKC. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי isoforms שונים של PKC translocate בתנאים שונים לתווך סוגים שונים של הפלסטיות הסינפטית וכי (5HT) סרוטונין הפעלת PKC Apl השנייה דורשת ייצור של שני DAG ו phosphatidic חומצה (רש"פ) עבור טרנסלוקציה ^1-2. חשוב לציין, את היכולת לדמיין את אותו הדבר שוב ושוב נוירון אפשרה לנו, למשל, כדי למדוד את הפחתת רגישות התגובה PKC בפירוט מעולה ^3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת Sf9 תרביות תאים, תרביות של נוירונים Aplysia חושית תוארו במאמר אחר וידאו ^4, להביע PKCS מתויג fluorescently ב Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי לחיות הדמיה טרנסלוקציה של PKC בתגובה activators שונים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית.

Protocol

1. הכנה ותחזוקה של Sf9 תרבויות monolayer Cell

1. Sf9 תרבית תאים והתחזוקה מתבצעת במנדף בתרבית רקמה.
2. Sf9 תאים מתאי Spodoptera frugiperda השחלות (Sf21 תאים) וכן ניתן לרכוש תאים קפואים התקשורת של גרייס מן Invitrogen.
3. מקום 8 מ"ל של מדיום החרק של גרייס, בתוספת (1X), אשר 30% עוברי שור בסרום (FBS) נוספה ב 75 ס"מ ² בקבוק תרבית תאים עם צוואר הנטוי.
4. ההפשרה הצינור הקפוא של Sf9 תאים במהירות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים על ידי העברת צינור הלוך ושוב (כ 1-2 דקות).
5. העברת Sf9 תאים 75 ס"מ ² בקבוק התרבות תאים צלחת רוק בעדינות ביד כדי לפזר את התאים באופן שווה.
6. דגירה 1-2 שעות ב 27 ° C עד התאים המצורפת.
7. הסר בינוני הישן ולהחליף עם 10 מ"ל של מדיום של חרקים freshGrace עם 30% FBS.
8. לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות.
9. כדי לשמור על תרבויות monolayer, להסיר בינוני הישן מהבקבוק ומחוברות של Sf9 תאים להוסיף 5 מ"ל של מדיום החרק של גרייס עם 10% FBS.
10. ברז קלות בצד של הבקבוק כמה פעמים כדי לנתק Sf9 תאים.
11. בעזרת פיפטה 10 מ"ל ו pipettor, פיפטה התקשורת מעלה ומטה פעם בעדינות, ריסוס קיר בקבוק תוך pipetting למטה. העברת התאים צינור סטרילי מ"ל 15 Polysterene.
12. הוסף 2 מ"ל של השעיה Sf9 התא 8 מ"ל של מדיום החרק של גרייס עם FBS 10% (בדילול 01:05 כדי לשמור על שלב הצמיחה יומן) של 75 ס"מ חדש בקבוקון ² תאים תרבות צלחת רוק בעדינות ביד.
13. לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות.

2. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently ב Sf9 תאים

1. בשביל לחיות הדמיה הניסוי, תרבות Sf9 תאים על 35 מ"מ MatTek זכוכית התחתונה תרבות disheswith משטח זכוכית של 14 מ"מ עובי ו coverslip של 0.16-0.19 מ"מ.
2. PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי Sf9 תאים באמצעות Cellfectin מגיב II transfection ההמלצה הבאה של היצרן בשינויים המפורטים להלן.
3. יום 1: לפני ציפוי התאים, להתייחס לכל צלחת MatTek בינוני עם החרק של גרייס עם FBS של 10% לפחות במשך 30 דקות.
4. הרוזן Sf9 תאים משלב 11 (לעיל) באמצעות hemacytometer.
5. פלייט 0.05 x 10 ⁶ תאים coverslip כל MatTek זכוכית בנפח כולל של 150 μL. אפשר לצרף את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הוסף 2 מ"ל של גרייס בתוספת 10% FBS כדי מ"ל כל מנה 1 בכל פעם לאט, כדי למנוע ניתוק התאים.
7. לדגור על 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
8. מנקודה זו ואילך, להשתמש המלצה של היצרן עבור transfection Sf9 של תאים עם פלסמיד דנ"א.
9. יום 2: Transfect Sf9 תאים עם PKCS מתויג fluorescently באמצעות Cellfectin מגיב II transfection. יש לנו לעתים קרובות שיתוף לידי ביטוי במערכת זו PKCS מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) ו monomeric חלבון פלואורסצנטי אדום (mRFP) (פרטים לבנייה פלסמיד תוארו בעבר ^2,5). הביטוי של חלבון אחד ניאון בזמן התשואות על 70-80% להביע תאים 72 שעות לאחר transfection. עמית הביטוי של שני חלבונים פלורסנט פוחתת יעילות transfection כדי כ -30% משותף המבטא תאים. כאשר שיתוף להביע eGFP-tagged PKC ו-mRFP מתויג PKC, להשתמש 2x-DNA פלסמיד יותר חלבון mRFP-tagged עבור ביטוי חלבון אופטימלית.
10. בצע לחיות הדמיה 48-72 שעות שלאחר transfection (ביטוי חלבון אופטימלי, להמתין 72 שעות).

3. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently בנוירונים Aplysia חושי

1. הכנת תרביות תאים עצביים Aplysia תוארה במאמר וידאו על ידי ג'או ⁴ עמיתים.
2. PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי נוירונים Aplysia חושית באמצעות הליך microinjection כמפורט להלן.
3. הכן פתרון המניות של גרין מהיר 1% (FCF) של מים מזוקקים, מסנן באמצעות מזרק מזרק 28 מ"מ פילטר (0.20 מיקרומטר). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
4. Microinjection של עצב סנסורי יכול להתבצע ביום 1 או 2 אחרי יום לבודד את הנוירונים אך אנו מוצאים כי מחכה 2 ימים מאפשר היצמדות התא עדיף coverslip.
5. ביום 2 לאחר בידוד של נוירונים חושיים, להפשיר aliquot של גרין מהיר לסנן אותו שוב באמצעות מזרק מזרק מסנן 28 מ"מ (0.20 מיקרומטר).
6. הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד המכיל מים מזוקקים בתוך הירוק מהיר 0.5%. ריכוזים של DNA פלסמיד גבוה ככל 0.4 מיקרוגרם / μL ניתן להשתמש אך לא מומלץ ללכת מעל ערכים אלה.
7. סנן את ה-DNA פלסמיד / פתרון ירוק מהיר באמצעות מזרק 1 מ"ל ו 4 מ"מ מזרק מסנן (0.20 מיקרומטר).
8. צנטריפוגה את הדנ"א פלסמיד / גרין פתרון מהיר ב XG 16,110 במשך 15 דקות באמצעות מיקרופוןrocentrifuge.
9. הכן אלקטרודות חדה microinjection של הנוירונים באמצעות חולץ microelectrode (סאטר Flaming / בראון micropipette פולר, דגם P-97). שימוש נימה תיבת, למשוך microelectrodes זכוכית בקוטר 1 מ"מ החיצוני, 0.75 מ"מ בתוך בקוטר 100 מ"מ אורך באמצעות קיר זכוכית דק נימים עם נימה בפנים (World Precision מכשירים TW100F-4). לקבלת מידע נוסף על משיכת אלקטרודות microinjection עיין ספר בישול אלקטרודה סאטר.
10. ממלאים כל אלקטרודה עם μL 2 של ה-DNA פלסמיד / גרין פתרון מהיר באמצעות פיפטה microloader קצה (Eppendorf CA32950-050).
11. מעבירים את תחתית הכוס MatTek תרבות צלחת המכילה תרבויות Aplysia העצבית לתחנת microinjection.
12. תחנת microinjection מורכב מהפעולות הבאות: תוצרת בית בשלב זכוכית גדול להחזיק את הכלים תרבות על השולחן רטט בידוד (קינטי בידוד מערכות עבודה רטט), מערכת סטריאו, היקף עם תאורה הלוגן חיצוני, micromanipulator (סאטר האקסלי Micromanipulator וול סוג אשר מאפשר מיצוב הן גס ו-Ultra קנס של שלושה צירים), מחזיק microelectrode מחוברת משאבה פנאומטי (מכשירים העולם Precision PV820 פניאומטיים Pico-Pump). קלט הלחץ של המשאבה פנאומטי מחובר טנק חנקן דחוס.
13. הכנס microelectrode לתוך מחזיק microelectrode.
14. צפייה במיקרוסקופ, סטריאו, הכנס את קצה micropipette לתוך גרעין התא.
15. העברת פולסים קצרים הלחץ של חנקן (10-100 ms משך: 20 £ / ב ²⁾ עד בגרעין הופך ירוק uniformely.
16. דגירה התאים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עבור טרנסלוקציה PKC אופטימלי, לבצע הדמיה לחיות הניסוי 20-24 שעות לאחר ההזרקה.

4. ויזואליזציה של טרנסלוקציה של PKC חיים Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

1. עבור הדמיה, אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss LSM510 confocal הפוכה עם 200 Axiovert.
2. הדמיה פרוטוקול זהה עבור Sf9 תאים עבור נוירונים Aplysia חושית למעט הבאים: Sf9 התאים הם צילמו עם מטרה x63 טבילה שמן ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו עם מטרה טבילה שמן X40. Sf9 התאים הם צילמו בחדר בקרת טמפרטורה שמרה על 26-27 ^{מעלות צלסיוס} ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו בטמפרטורת החדר נשמר סביב 18-20 ^o C.
3. אנו משתמשים 30 mW ארגון לייזר (עירור ב 488nm) עם פלט לייזר 50% PKC תמונה מתוייגים עם חלבון ו eGFP לייזר HeNe (עירור ב 543nm) כדי PKC תמונה מתוייגים עם חלבון mRFP. ארגון ו HeNe קווי לייזר נחלש ל -4% ואת התפוקה העברת 50% בהתאמה לפני הדמיה חריר מותאם אחד.
4. חשוב לקבל את המנה תרבות התייצב על הבמה הדמיה כדי למנוע תנועה או רטט.
5. הסרה של 1 מ"ל של התקשורת בתרבות מצלחת בעדינות בעזרת פיפטה 10 מ"ל עוזב נפח 1 מ"ל סך המנה.
6. צלמו תמונות בחלק האמצעי של התאים בהם את הגרעין ניתן לראות.
7. הגדרת סדרת זמן של 10-20 תמונות confocal לצלם כל 30 שניות.
8. התחילו את סדרת זמן.
9. לאחר 2 תמונות נלקחים (אחרי נקודת זמן 30 שניות), מוסיפים 1 מ"ל של התרופה (2X ריכוז) בעדינות טיפה אחר טיפה על גבי התאים בעזרת פיפטה P1000. התרופה היא הוסיפה ברציפות במשך כ -30 שניות.
10. חלק מהתרופות לגרום טרנסלוקציה מהיר אשר ניתן לראות מיד לאחר טיפול תרופתי (בנקודת זמן 60 שניות), בעוד שאחרים לגרום טרנסלוקציה איטי וזה רק 50-10 דקות אופטימלי שלאחר הטיפול (סרט 1 סרט ו 2).
11. אם התרופה צריכה להיות נשטף, להשתמש 2 x 10 מ"ל pipets לעשות כביסה, pipetting החיץ לשטוף בעדינות עם פיפטה אחת על צד אחד של תבשיל ו pipeting את המדיה בצד השני.
12. אם לשטוף את כבר יעיל אם את האפקט של התרופה הוא הפיך, PKC יחזרו cytosol בתוך 30-60 שניות.
13. שמור את הסרט כקובץ LSM.
14. השתמש NIH תוכנה J תמונה כדי לפתוח את הקבצים LSM ולכמת תמונות הקדם ואת הטיפול התרופתי הודעה. כימות תוארה במקום אחר ^1.

Discussion

תיארנו טכניקה הדימוי של טרנסלוקציה PKCS מתויג fluorescently בזמן אמת Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושית. Sf9 תאים לספק מערכת פשוטה טרנסלוקציה תמונה PKC מאז culturing ו transfecting אותם הוא די ישר קדימה. לעומת זאת, microinjection של נוירונים Aplysia חושית לוקח קצת זמן כדי לשלוט; עד כמה חודשים. קשיים הקשורים טכניקה זו כוללת סתימת אלקטרודה. סינון הפתרון הזרקת centrifuging זה בדרך כלל עוזר אבל בועות אוויר לפעמים יכול להיווצר האלקטרודה בעת מילוי אותו. אנו מוצאים כי באמצעות פיפטה טיפים microloader למלא את האלקטרודה במקום קפילריות מסייעת לצמצם את היווצרות של בועות אוויר. בנוגע לחיות הדמיה, שני הגורמים צריכים להיות תחת פיקוח הדוק במהלך הפגישה הדמיה: טמפרטורה ותנועה. תנודות הטמפרטורה עשויה להשפיע טרנסלוקציה ושימוש קאמרית בקרת טמפרטורה צריך להיחשב. כדי למנוע תנועה במהלך הדמיה, שולחן בידוד רעידות ניתן להשתמש.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis