Summary
In questo video, dimostriamo la visualizzazione di traslocazione della PKC nelle cellule viventi utilizzando PKCS fluorescente tag.
Abstract
Proteina chinasi C (PKCS) sono serina treonina chinasi che svolgono un ruolo centrale nella regolazione una vasta gamma di processi cellulari, come la crescita cellulare e di apprendimento e memoria. Ci sono quattro famiglie note delle isoforme PKC nei vertebrati: PKCS classica (α, βI, βII e γ), nuovo tipo I PKCS (ε e η), romanzo di tipo II PKCS (δ e θ), e PKCS atipici (ζ e ι ). Il PKCS classici sono attivati dal Ca 2 + e diacylclycerol (DAG), mentre il PKCS romanzo sono attivati da DAG, ma sono Ca 2 +-indipendenti. Il PKCS atipici sono attivati né Ca 2 + né DAG. In Aplysia californica, il nostro sistema modello per studiare la formazione della memoria, ci sono tre isoforme specifiche del sistema nervoso PKC uno per ogni categoria principale, cioè la tradizionale PKC ho Apl, il tipo di romanzo che PKC Apl II e il III atipico PKC Apl. PKCS sono lipidi-chinasi attivate, e quindi l'attivazione di PKCS classico e romanzo in risposta a segnali extracellulari è stata spesso correlata con traslocazione della PKC dal citoplasma alla membrana plasmatica. Pertanto, visualizzando traslocazione della PKC in tempo reale in cellule vive è diventato uno strumento prezioso per chiarire le vie di trasduzione del segnale che portano all'attivazione della PKC. Per esempio, questa tecnica ha permesso di stabilire che diverse isoforme della PKC traslocare in condizioni diverse di mediare tipi distinti di plasticità sinaptica e che (5HT) l'attivazione della PKC serotonina Apl II richiede la produzione di entrambi i DAG e acido fosfatidico (PA) per traslocazione 1-2. Soprattutto, la capacità di visualizzare il neurone ripetutamente lo stesso ci ha permesso, ad esempio, per misurare desensibilizzazione della risposta PKC nei minimi dettagli 3. In questo video, dimostriamo ogni fase della preparazione SF9 colture cellulari, colture di neuroni sensoriali Aplysia sono stati descritti in un altro articolo video 4, esprimendo PKCS fluorescente taggato in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali e Aplysia live-imaging di traslocazione della PKC in risposta a attivatori diversi utilizzando la microscopia a scansione laser.
Protocol
1. Preparazione e manutenzione di colture cellulari monostrato SF9
- SF9 coltura cellulare e la manutenzione viene eseguita in una cappa di coltura di tessuti.
- SF9 cellule derivano da cellule ovariche di Spodoptera frugiperda (Sf21 cellule) e può essere acquistato come cellule congelate nei mezzi di comunicazione di Grace da Invitrogen.
- Luogo 8 mL di medium insetti Grace, integrati (1X), per cui il 30% di siero fetale bovino (FBS) è stato aggiunto in un centimetro 75 2 fiasco coltura cellulare con un collo inclinato.
- Scongelare il tubo ghiacciato di SF9 cellule rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C il tubo muovendo avanti e indietro (circa 1-2 minuti).
- Trasferimento SF9 celle a centimetri 75 2 fiasco di coltura cellulare e placca rocciosa delicatamente a mano per distribuire le cellule in modo uniforme.
- Incubare per 1-2 ore a 27 ° C fino a quando le cellule sono collegati.
- Rimuovere media vecchi e sostituirli con 10 ml di medium insetti freshGrace con 30% FBS.
- Incubare a 27 ° C fino a quando le cellule sono confluenti.
- Per mantenere colture monostrato, rimuovere medio vecchio pallone di confluenza di SF9 cellule e aggiungere 5 ml di medium insetti di Grace con il 10% FBS.
- Toccare leggermente sul lato del pallone più volte a staccare SF9 cellule.
- Usando una pipetta 10 ml e una pipetta, pipetta i media una volta su e giù dolcemente, spruzzando muro fiasco durante il pipettaggio in giù. Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo polistirolo.
- Aggiungere 2 ml di sospensione cellulare SF9 a 8 ml di terreno insetti di Grace con il 10% FBS (diluizione 1:5 per mantenere la fase di crescita log) nel nuovo 75 cm 2 fiasco di coltura cellulare e placca rocciosa delicatamente a mano.
- Incubare a 27 ° C fino a quando le cellule sono confluenti.
2. Espressione di PKCS fluorescente Tagged in SF9 cellule
- Per le immagini live-esperimento, della cultura SF9 celle da 35 mm cultura MatTek disheswith fondo di vetro una superficie di vetro di 14 mm e uno spessore di 0,16 coprioggetto a 0.19 mm.
- PKCS taggati con proteine fluorescenti sono espressi in SF9 cellule utilizzando Cellfectin raccomandazione transfezione II reagente a seguito del costruttore con le modifiche riportate di seguito.
- 1 ° giorno: Prima di placcatura le cellule, il trattamento di ogni piatto MatTek con il mezzo di insetti di Grace con il 10% FBS per almeno 30 minuti.
- Conte SF9 cellule dal punto 11 (sopra) utilizzando un emocitometro.
- Piastra 0,05 x 10 6 cellule per ogni vetrino di vetro MatTek in un volume totale di 150 microlitri. Permettono alle cellule di attaccare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2 ml di Grazia è integrato con il 10% FBS per ogni ml piatto 1 alla volta lentamente per evitare di staccare le cellule.
- Incubare a 27 ° C durante la notte.
- Da questo punto in poi, l'uso raccomandazione del produttore per la transfezione di SF9 cellule con DNA plasmidico.
- 2 ° giorno: SF9 trasfezione delle cellule con PKCS fluorescente marcato mediante Cellfectin reagenti di trasfezione II. Abbiamo spesso co-espressi in questo sistema PKCS taggati con maggiore proteina verde fluorescente (eGFP) e monomerico proteina fluorescente rossa (MRFP) (dettagli per la costruzione plasmide sono state precedentemente descritte 2,5). Espressione di una proteina fluorescente in un momento produce circa il 70-80% che esprimono celle 72 ore dopo la trasfezione. Co-espressione di due proteine fluorescenti diminuisce l'efficienza di trasfezione a circa il 30% di co-cellule che esprimono. Quando co-esprimono eGFP-tagged PKC e MRFP-tagged PKC, utilizzare 2x DNA più plasmide per la MRFP-tag proteine per espressione di proteine ottimale.
- Esibirsi dal vivo-imaging 48-72 ore post-trasfezione (per l'espressione delle proteine ottimali, attendere 72 ore).
3. Espressione di PKCS fluorescente Tagged nei neuroni sensoriali Aplysia
- Preparazione di colture cellulari neuronali Aplysia è stato descritto in un articolo video di Zhao e 4 colleghi.
- PKCS taggati con proteine fluorescenti sono espressi nei neuroni sensoriali Aplysia tramite microiniezione procedura dettagliata di seguito.
- Preparare una soluzione madre di 1% Verde fast (FCF) in acqua distillata, filtrare utilizzando una siringa e una siringa da 28 mm filtro (0,20 micron). Aliquota e conservare a -20 ° C.
- Microiniezione dei neuroni sensoriali può essere eseguita il giorno 1 o giorno 2 dopo aver isolato i neuroni, ma troviamo che aspettare 2 giorni permette una migliore aderenza delle cellule del coprioggetto.
- Il giorno 2 dopo l'isolamento dei neuroni sensoriali, disgelo un'aliquota di Green veloce e filtrare di nuovo con una siringa e una siringa da 28 mm filtro (0,20 micron).
- Preparare una soluzione di DNA plasmidico in acqua distillata contenente 0,5% Verde veloce. Le concentrazioni di DNA plasmidico più in alto di 0,4 mg / mL può essere usato ma non è consigliabile andare di sopra di questi valori.
- Filtrare il DNA plasmidico / Fast soluzione verde con una siringa da 1 ml e una siringa da 4 mm filtro (0,20 micron).
- Centrifugare il DNA plasmidico / Fast soluzione verde a 16110 xg per 15 minuti utilizzando un microfonorocentrifuge.
- Preparare elettrodi forte per microiniezione di neuroni con un estrattore microelettrodo (Sutter Flaming / Brown Micropipetta Puller, modello P-97). Utilizzando un filamento scatola, tirare microelettrodi di vetro con 1 mm di diametro esterno, 0,75 mm di diametro interno e 100 mm di lunghezza con sottile parete di vetro capillari con un filamento interno (World Strumenti di precisione TW100F-4). Per ulteriori informazioni sulla tirando elettrodi microiniezione fare riferimento al libro di cucina Sutter elettrodo.
- Riempire ogni elettrodo con 2 ml di DNA plasmidico / Fast soluzione verde utilizzando microloader puntale (eppendorf CA32950-050).
- Trasferire il piatto di vetro MatTek fondo di coltura contenente culture Aplysia neuronali alla stazione di microiniezione.
- La stazione di microiniezione è costituito dai seguenti: una fatta in casa grande palcoscenico di vetro per contenere i piatti della cultura su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni (Kinetic workstation vibrazioni Sistemi di isolamento), un impianto stereo-scope alogeni con illuminazione esterna, un micromanipolatore (Sutter Huxley Micromanipolatore Tipo di parete che consente il posizionamento sia grossolana e ultra-sottile nei tre assi), titolare di un microelettrodo collegato ad una pompa pneumatica (Strumenti di precisione mondiale PV820 pneumatico Pico-pompa). L'ingresso di pressione della pompa pneumatica è collegato ad un serbatoio di azoto compresso.
- Inserire un microelettrodo nel supporto microelettrodo.
- Guarda sotto uno stereo-microscopio, inserire la punta della micropipetta nel nucleo delle cellule.
- Fornire impulsi di pressione a corto di azoto (da 10 a 100 ms di durata, 20 lb / in 2) fino a quando il nucleo diventa uniformemente verdi.
- Incubare le cellule per 4 ore a temperatura ambiente e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Per ottimale traslocazione della PKC, esibirsi dal vivo-imaging esperimento 20-24 ore dopo l'iniezione.
4. Visualizzazione di traslocazione della PKC in Living SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia
- Per l'imaging, usiamo un microscopio invertito Zeiss LSM510 confocale con un Axiovert 200.
- Imaging protocollo è lo stesso per SF9 cellule e dei neuroni sensoriali Aplysia eccezione dei seguenti: SF9 cellule sono ripreso con un obiettivo x63 olio da immersione, mentre i neuroni sensoriali sono Aplysia ripreso con un obiettivo ad immersione olio x40. SF9 cellule vengono esposte a una temperatura controllata camera mantenuta a 26-27 ° C mentre i neuroni di Aplysia sensoriali vengono esposte a temperatura ambiente mantenuto circa 18-20 ° C.
- Usiamo un 30 mW Argon laser (eccitazione a 488 nm) con uscita laser 50% al PKC immagine taggati con proteine eGFP e un laser HeNe (eccitazione a 543nm) per PKC immagine taggati con proteine MRFP. L'argon e HeNe linee laser sono attenuate al 4% e potenza di trasmissione 50%, rispettivamente prima imaging e il foro stenopeico è regolato a uno.
- E 'importante avere il piatto cultura stabilizzato sul palco di imaging e di evitare movimenti o vibrazioni.
- Togliere 1 ml di terreni di coltura dal piatto delicatamente con una pipetta 10 ml lasciando 1 mL volume totale nel piatto.
- Per scattare le foto nella sezione centrale della cellula in cui il nucleo può essere visto.
- Impostare una serie temporale di 10-20 immagini confocale di scattare una foto ogni 30 secondi.
- Inizio della serie storica.
- Dopo 2 immagini sono prese (dopo il tempo di 30 punti secondi), aggiungere 1 ml del farmaco (2X concentrazione) delicatamente goccia a goccia sulla parte superiore delle celle usando una pipetta P1000. Il farmaco è aggiunto continuamente per circa 30 secondi.
- Alcuni farmaci inducono una traslocazione veloce che può essere visibile immediatamente dopo il trattamento farmacologico (al momento 60 punti secondi), mentre altri indurre una traslocazione lento che è a pochi minuti ottimale 5-10 post-trattamento (Movie Movie 1 e 2).
- Se il farmaco deve essere lavato via, usare pipette 2 x 10 ml di fare il lavaggio, pipettaggio il tampone di lavaggio giù delicatamente con una pipetta da un lato del piatto e pipeting il supporto sul lato opposto.
- Se il lavaggio è stato efficace e se l'effetto del farmaco è reversibile, PKC torna al citosol entro 30-60 secondi.
- Salvare il filmato come file LSM.
- Usa immagine NIH J software per aprire i file LSM e quantificare le immagini pre e post trattamento farmacologico. La quantificazione è stata descritta altrove 1.
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Discussion
Abbiamo descritto una tecnica per traslocazione immagine di PKCS fluorescente taggato in tempo reale in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia. SF9 cellule fornire un sistema semplice per traslocazione immagine PKC dal coltura e trasfezione loro è molto semplice in avanti. Al contrario, la microiniezione di neuroni sensoriali Aplysia vuole del tempo per padroneggiare, fino a pochi mesi. Difficoltà legate a questa tecnica comprendono l'intasamento degli elettrodi. Filtraggio della soluzione iniettabile e centrifugazione di solito aiuta, ma a volte le bolle d'aria possono formare in l'elettrodo mentre riempiendo. Troviamo che con la punta della pipetta microloader per riempire l'elettrodo, invece di capillarità aiuta a minimizzare la formazione di bolle d'aria. Per quanto riguarda live-imaging, due fattori devono essere strettamente controllati durante la sessione di imaging: la temperatura e movimento. Fluttuazioni di temperatura potrebbero influenzare la traslocazione e l'uso di una temperatura controllata camera deve essere considerato. Per evitare movimenti durante l'imaging, un tavolo isolamento dalle vibrazioni possono essere utilizzati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Concessione di S. Wayne Sossin. Carole A. Farah è il destinatario di una borsa di studio post-dottorato dal Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e una borsa di studio Conrad Harrington. Gli autori desiderano ringraziare Joanna Bougie, Margaret Hastings e Margaret Labban aiuto per le riprese video e Madeline piscina Richmond per aiutare con la panoramica grafica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
