Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten
Summary
Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.
Abstract
Succesvolle en nauwkeurige analyse en interpretatie van metagenomic gegevens is afhankelijk van de efficiënte afzuiging van hoge kwaliteit, hoge moleculair gewicht (HMW) gemeenschap DNA. Echter, het milieu mat monsters nogal eens voor problemen op het verkrijgen van grote concentraties van hoge kwaliteit, HMW DNA. Hypersaline microbiële matten bevatten grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS), een en zouten die kan remmen afgeleide toepassingen van de geëxtraheerde DNA. Direct en harde methoden worden vaak gebruikt in de DNA-extractie van vuurvaste monsters. Deze methoden worden vaak gebruikt omdat de winst per aandeel in matten, een klevende matrix, bindt DNA 2,3 in de directe lysis. Als gevolg van de hardere extractiemethoden, DNA gefragmenteerd raakt in kleine maten 4,5,6.
Het DNA wordt dus niet geschikt voor grote-insert vector klonen. Om deze beperkingen te omzeilen, hebben we een verslag van een verbeterde methodologie voor HMW DNA van goede kwaliteit en kwantiteit van hypersaline microbiële matten extract. We gebruikten een indirecte methode waarbij de scheiding van microbiële cellen van de achtergrond mat matrix door middel van het mengen en het differentieel centrifugeren. Een combinatie van mechanische en chemische procedures werd gebruikt om DNA extraheren en te zuiveren van de uitgepakte microbiële cellen. Ons protocol levert ongeveer 2 ug van HMW DNA (35-50 kb) per gram monster mat, met een A 260/280 ratio van 1,6. Bovendien is versterking van de 16S rRNA genen 7 suggereert dat het protocol in staat is te minimaliseren of te elimineren remmende effecten van verontreinigingen. Onze resultaten geven een geschikte methode voor de extractie van HMW DNA van microbiële matten voor functionele metagenomic studies en van toepassing kunnen zijn op andere milieu-monsters waaruit DNA-extractie is een uitdaging.
Protocol
Discussion
Gezien het feit dat de totale cel verwijdering uit complex en zeer diverse microbiële mat monsters niet praktisch is, de primaire zorg is hoe goed de uitgepakte de cellen van het totale microbiële mat gemeenschap te vertegenwoordigen. In een eerdere studie, PCR-DGGE analyse van microbiële 16S rRNA genen toonde aan dat de vijf cel verwijderen van de stappen in dit protocol gebruikte cellen die representatief zijn voor de totale microbiële mat gemeenschap 7 extracten. Het werkelijke aantal cel-extractie sta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation Environmental Program Genomics (Grant No EF-0723707).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).
- Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials. J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).
- Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples. Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).
- de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis. Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats. Biotechniques. 49, 631-640 (2010).
- Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics. Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).
- Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).
- Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea. Science. 289, 1902-1906 (2000).
