バイオマットから高分子量DNAの抽出
Summary
我々は、塩性微生物マットから高分子量のDNAを抽出するための改良されたプロトコルを提供しています。微生物細胞は、DNAの抽出と精製の前にマットのマトリックスから分離されています。これは、濃度、品質、およびDNAの大きさを高めます。プロトコルは、他の難治性のサンプルに使用することができる。
Abstract
メタゲノムデータの成功したと正確な分析と解釈は、質の高い、高分子量（HMW）のコミュニティDNAの効率的な抽出に依存しています。しかし、環境マットのサンプルは、しばしば高品質の、HMWのDNAの大規模な濃度を得るために困難をもたらす。塩性の微生物マットは高い細胞外高分子物質の量（EPS）1、抽出されたDNAの下流のアプリケーションを阻害する塩が含まれています。ダイレクトと厳しい方法は、しばしば難治性の試料からのDNA抽出に使用されています。マット、接着剤マトリックス、のEPSは直接溶解中にDNA 2,3を結合するので、これらのメソッドは一般的に使用されています。厳しい抽出方法の結果として、DNAは、小さいサイズ4,5,6に分割になります。
DNAは、このように大規模挿入ベクトルのクローニングには不適切となります。これらの制限を回避するために、我々は塩性微生物マットから良い質と量のHMW DNAを抽出するために改良された方法論を報告する。我々はブレンドと分画遠心法を通じて、背景のマットマトリックスからの微生物細胞の分離を伴う間接的な方法を採用。機械的および化学的手順の組み合わせは、抽出された微生物細胞からDNAを抽出精製するために使用された。我々のプロトコルは1.6の280分の260比で、マットのサンプルのグラム当たりHMW DNA（35〜50キロバイト）の約2μgを得られます。また、16S rRNA遺伝子7の増幅は、プロトコルが汚染物質のいずれかの阻害効果を最小化または排除することができることを示唆している。我々の結果は、機能的なメタゲノム研究のためのバイオマットからHMWのDNAの抽出のための適切な方法論を提供し、DNA抽出が難しいされているから、他の環境試料にも適用可能である。
Protocol
Discussion
複雑かつ高度に多様な微生物マット試料からの全細胞の除去が実用的ではないことを考えると、主な関心事は、抽出された細胞は、全体的な微生物マットのコミュニティを表す方法もあります。以前の研究で、微生物の16S rRNA遺伝子のPCR – DGGE解析では、このプロトコルで使用する5つの細胞の除去の手順は、全体的な微生物マットのコミュニティ7の代表的な細胞を抽出することを示し…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、全米科学財団環境ゲノミクスプログラム（グラント番号EF – 0723707）により賄われていた。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
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