Добыча высокомолекулярных ДНК Вес от микробных матах
Summary
Мы предоставляем улучшенный протокол для извлечения ДНК высокого молекулярного веса от гиперсоленых коврики микроорганизмов. Микробные клетки отделяются от мата матрицы до выделения ДНК и очистки. Это повышает концентрацию, качество и размер ДНК. Протокол может быть использован для других огнеупорных образцов.
Abstract
Успешные и точный анализ и интерпретация метагеномных данных зависит от эффективной добычи высокого качества, высокой молекулярной массы (HMW) сообщества ДНК. Тем не менее, пробы окружающей среды мат часто создают трудности для получения больших концентраций высокого качества, ДНК HMW. Коврики гиперсоленых микробной содержат большое количество внеклеточных полимерных веществ (EPS) 1 и солей, которые могут препятствовать течению приложений добываемого ДНК. Прямые и жесткие методы часто используются в экстракции ДНК из тугоплавких образцов. Эти методы, как правило, используется, потому что ЭПС в маты, клей матрицы, связывает ДНК 2,3 при прямой лизис. В результате жестких методов добычи, ДНК становится раздроблена на небольшие размеры 4,5,6.
ДНК таким образом, становится не подходит для больших вставить вектор клонирования. Для того чтобы обойти эти ограничения, мы сообщаем усовершенствованной методологии для извлечения ДНК HMW хорошего качества и количества из гиперсоленых коврики микроорганизмов. Мы использовали косвенный метод предусматривающее разделения микробных клеток из матрицы фоне мат через смешивание и дифференциального центрифугирования. Сочетание механических и химических процедур используются для извлечения и очистки ДНК из извлеченных микробных клеток. Наш протокол дает примерно 2 мкг HMW ДНК (35-50 кб) на грамм коврик образца, с 260/280 отношением 1,6. Кроме того, усиление генов 16S рРНК 7 предполагает, что протокол может уменьшить или устранить любые тормозящее действие загрязняющих веществ. Наши результаты дают соответствующую методологию для извлечения ДНК из HMW микробных матах для функциональной метагеномных исследований и могут быть применимы к другим проб окружающей среды, из которой экстракции ДНК является сложной задачей.
Protocol
Discussion
Учитывая, что полное удаление ячейки из сложных и весьма разнообразны образцы микробного мата невозможно, главной задачей является, как хорошо извлеченные клетки представляют всего сообщества коврик микроорганизмов. В предыдущем исследовании, ПЦР-анализ DGGE микробных генов 16S рРНК по?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным научным фондом экологического Genomics программы (грант № EF-0723707).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).
- Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials. J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).
- Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples. Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).
- de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis. Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats. Biotechniques. 49, 631-640 (2010).
- Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics. Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).
- Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).
- Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea. Science. 289, 1902-1906 (2000).
