La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos
Summary
Ofrecemos un protocolo mejorado para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Las células microbianas son separados de la matriz de alfombra antes de la extracción y purificación del ADN. Esto mejora la concentración, calidad y tamaño de la DNA. El protocolo puede ser utilizado para otras muestras de refractario.
Abstract
Análisis de éxito y preciso y la interpretación de los datos de metagenómica depende de la extracción eficiente de alta calidad, la comunidad de ADN de alto peso molecular (HMW). Sin embargo, las muestras ambientales colchoneta a menudo plantean dificultades para la obtención de grandes concentraciones de alta calidad, de alto peso molecular del ADN. Tapetes microbianos hipersalinos contienen altas cantidades de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) 1 y las sales que pueden inhibir aplicaciones posteriores del ADN extraído. Los métodos directos y las duras a menudo se utilizan en la extracción de ADN de muestras de refractario. Estos métodos se utilizan normalmente debido a que la EPS en esteras, una matriz adhesiva, une el ADN 2,3 durante la lisis directa. Como resultado de los métodos de extracción más dura, el ADN se fragmenta en pequeños tamaños 4,5,6.
El ADN se convierte en inadecuado para la reproducción de vectores de gran inserción. Con el fin de sortear estas limitaciones, se presenta una metodología mejorada para extraer el ADN de alto peso molecular de buena calidad y cantidad de tapetes microbianos hipersalinos. Se empleó un método indirecto, que supone la separación de las células microbianas de la matriz de alfombra de fondo a través de la mezcla y centrifugación diferencial. Una combinación de procedimientos mecánicos y químicos se utilizó para extraer y purificar el ADN de las células microbianas extraídos. El protocolo de los rendimientos de aproximadamente 2 g de ADN de alto peso molecular (35-50 kb) por gramo de muestra de alfombra, con un ratio de 1,6 260/280. Por otra parte, la amplificación de genes del 16S rRNA 7 sugiere que el protocolo es capaz de minimizar o eliminar los efectos inhibitorios de los contaminantes. Nuestros resultados proporcionan una metodología adecuada para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos de los estudios de metagenómica funcional y puede ser aplicable a otras muestras ambientales de la extracción de ADN, que es un reto.
Protocol
Discussion
Teniendo en cuenta que la eliminación total de las células de las muestras de alfombra complejos y muy variados microbiana no es práctico, la principal preocupación es qué tan bien las células extraídas representar a la comunidad microbiana alfombra en general. En un estudio previo, PCR-DGGE análisis de microorganismos genes del 16S rRNA mostró que la eliminación de cinco pasos de células utilizadas en este protocolo de extractos de células que son representativos de la comunidad microbiana alfombra en gener…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional Science Foundation Ambiental Genómica (Grant No. EF-0723707).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
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