Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten
Summary
Wir bieten ein verbessertes Protokoll zur Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus hypersaline mikrobielle Matten. Mikrobielle Zellen sind von der Matte Matrix vor der DNA-Extraktion und Reinigung getrennt. Dies erhöht die Konzentration, Qualität und Größe der DNA. Das Protokoll kann für andere feuerfeste Proben verwendet werden.
Abstract
Erfolgreiche und genaue Analyse und Interpretation von Daten metagenomische ist abhängig von der effizienten Gewinnung von hochwertigen, mit hohem Molekulargewicht (HMW)-Community DNA. Doch Umwelt-mat Proben stellen häufig Schwierigkeiten zu erhalten hohe Konzentrationen von hoher Qualität, HMW-DNA. Hypersalinen mikrobiellen Matten enthalten hohe Mengen an extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 1 und Salze, die Downstream-Anwendungen der extrahierten DNA hemmen können. Direkte und harte Methoden sind oft in der DNA-Extraktion aus feuerfestem Proben verwendet. Diese Methoden sind in der Regel verwendet, da das EPS in Matten, Klebstoff-Matrix, bindet DNA 2,3 während der direkten Lyse. Als Folge der härteren Extraktionsmethoden, DNA wird in kleinen Größen 4,5,6 fragmentiert.
Die DNA wird somit ungeeignet für große Insert-Vektor Klonen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, melden wir eine verbesserte Methodik zur HMW-DNA von guter Qualität und Quantität von hypersaline mikrobiellen Matten extrahieren. Wir verwendeten eine indirekte Methode, die die Trennung von mikrobiellen Zellen aus dem Hintergrund Matte Matrix durch Mischen und differentielle Zentrifugation. Eine Kombination aus mechanischen und chemischen Verfahren wurde verwendet, um zu extrahieren und zu reinigen DNA aus den extrahierten mikrobieller Zellen. Unser Protokoll ergibt etwa 2 ug HMW-DNA (35-50 kb) pro Gramm Matte Probe, mit einer A 260/280 Ratio von 1,6. Darüber hinaus schlägt Amplifikation von 16S rRNA-Gene 7, die das Protokoll in der Lage, minimieren oder zu eliminieren hemmenden Wirkungen von Verunreinigungen ist. Unsere Ergebnisse liefern eine geeignete Methode zur Extraktion von HMW-DNA aus mikrobiellen Matten für funktionale metagenomische Studien und kann auf andere Umwelt-Proben, aus denen die DNA-Extraktion ist eine Herausforderung.
Protocol
Discussion
Da die gesamte Zelle Entnahme aus komplexen und sehr unterschiedlichen mikrobiellen Matte Proben nicht praktikabel ist, ist die wichtigste Angelegenheit, wie gut die extrahierten Zellen die gesamte mikrobielle Matte Gemeinschaft darstellen. In einer früheren Studie zeigte PCR-DGGE Analyse mikrobieller 16S rRNA-Gene, dass die fünf Zelle Ausbauschritte in diesem Protokoll verwendeten Zellen, die repräsentativ für die Gesamtheit mikrobiellen Matte Gemeinschaft 7 sind Extrakte. Die tatsächliche Anzahl der Ze…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Environmental Genomics Program (Grant No EF-0723707) gefördert.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
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