הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית
Summary
אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.
Abstract
ניתוח מוצלח ומדויק ופרשנות של נתונים metagenomic תלוי מיצוי יעיל של באיכות גבוהה, ה-DNA מולקולרי גבוה (HMW) במשקל הקהילה. עם זאת, דגימות מחצלת סביבתיים מהווים לעיתים קרובות בקשיים להשגת ריכוזים גדולים של ה-DNA באיכות גבוהה HMW,. מחצלות Hypersaline חיידקים מכילים כמויות גדולות של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 1 ומלחים שעשויים לעכב יישומים במורד הזרם של ה-DNA חילוץ. שיטות ישיר וקשה משמשים לעיתים קרובות מיצוי דנ"א מדגימות עקשן. שיטות אלה משמשים בדרך כלל משום למניה ב מחצלות, מטריצה דבק, נקשר ה-DNA 2,3 במהלך תמוגה ישיר. כתוצאה שיטות מיצוי קשים, ה-DNA הופך מקוטעת לתוך בגדלים קטנים 4,5,6.
ה-DNA ובכך הופך הולם שיבוט גדול להכניס וקטור. על מנת לעקוף את המגבלות האלה, אנו מדווחים על מתודולוגיה משופרת להפיק דנ"א HMW באיכות וכמות טובה של מחצלות חיידקים hypersaline. אנחנו עובדים בשיטה עקיפה מעורבים הפרדת תאים מיקרוביאליים מהמטריצה רקע מחצלת באמצעות מיזוג צנטריפוגה ההפרש. שילוב של נהלים מכני וכימי שימש כדי לחלץ ולטהר DNA מתאי חיידקים שחולצו. פרוטוקול שלנו התשואות כ -2 מיקרוגרם של HMW DNA (35-50 kb) לגרם מדגם מחצלת, עם יחס של 260/280 1.6. יתר על כן, הגברה של גנים 16S rRNA 7 עולה כי הפרוטוקול יכול להקטין או למנוע תופעות מעכבות של מזהמים. התוצאות שלנו לספק המתודולוגיה המתאימה החילוץ של ה-DNA HMW מ מחצלות חיידקים ללימודי metagenomic פונקציונלי עשויות לחול על דגימות סביבתיות אחרות שמהן מיצוי DNA הוא מאתגר.
Protocol
Discussion
בהתחשב בכך הכולל הסרת תאים מדגימות מחצלת מורכב ומגוון מאוד של חיידקים אינה מעשית, הדאגה העיקרית היא באיזו מידה את התאים חילוץ לייצג את הקהילה הכוללת מחצלת מיקרוביאלי. במחקר קודם, ה-PCR-DGGE ניתוח של גנים 16S rRNA הראו כי חיידקים חמש הסרת תא צעדים להשתמש בפרוטוקול זה תמציות ת?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית קרן המדע הלאומית Genomics הסביבה (גרנט לא EF-0723707).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).
- Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials. J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).
- Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples. Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).
- de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis. Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats. Biotechniques. 49, 631-640 (2010).
- Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics. Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).
- Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).
- Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea. Science. 289, 1902-1906 (2000).
