Extraction d'ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens
Summary
Nous fournissons un protocole amélioré pour l'extraction ADN de haut poids moléculaire à partir de tapis microbiens hypersalin. Les cellules microbiennes sont séparés de la matrice mat avant l'extraction de l'ADN et de purification. Cela améliore la concentration, la qualité et la taille de l'ADN. Le protocole peut être utilisé pour d'autres échantillons réfractaires.
Abstract
Analyse réussie et exacte et l'interprétation des données métagénomiques dépend de l'extraction efficace de haute qualité, l'ADN de haut poids moléculaire de la communauté (HMW). Cependant, les échantillons environnementaux posent souvent des tapis de difficultés à obtenir de grandes concentrations de haute qualité, l'ADN HMW. Tapis microbiens hypersalin contiennent des quantités élevées de substances polymériques extracellulaires (EPS) 1 et les sels qui peuvent inhiber les applications en aval de l'ADN extrait. Les méthodes directes et dures sont souvent utilisés dans l'extraction d'ADN à partir d'échantillons réfractaires. Ces méthodes sont généralement utilisées parce que le BPA dans des nattes, une matrice adhésive, lie l'ADN 2,3 lors de la lyse directe. En raison de méthodes d'extraction plus sévères, l'ADN se fragmente en petites tailles 4,5,6.
L'ADN devient donc inapproprié pour le vecteur de clonage à grande insérer. Afin de contourner ces limitations, nous présentons une méthodologie améliorée pour en extraire l'ADN HMW de bonne qualité et la quantité de tapis microbiens hypersalin. Nous avons utilisé une méthode indirecte impliquant la séparation des cellules microbiennes de la matrice mat fond par mélange et centrifugation différentielle. Une combinaison de procédés mécaniques et chimiques a été utilisé pour extraire et purifier l'ADN des cellules microbiennes extrait. Notre protocole de rendements d'environ 2 pg d'ADN HMW (35-50 ko) par gramme d'échantillon mat, avec un A 260/280 ratio de 1,6. Par ailleurs, l'amplification des gènes d'ARNr 16S 7 suggère que le protocole est en mesure de minimiser ou éliminer les effets inhibiteurs de contaminants. Nos résultats fournissent une méthodologie appropriée pour l'extraction d'ADN à partir HMW tapis microbiens fonctionnels pour les études métagénomiques et peut être applicable à d'autres échantillons environnementaux à partir de laquelle l'extraction d'ADN est un défi.
Protocol
Discussion
Étant donné que l'élimination totale des cellules du complexe et très diversifié échantillons des tapis microbiens n'est pas pratique, la principale préoccupation est de savoir comment bien les cellules extraites de représenter la communauté microbienne globale tapis. Dans une étude précédente, la PCR-DGGE analyse des gènes microbiens ARNr 16S ont montré que les cinq étapes d'élimination des cellules utilisées dans le présent protocole d'extraits des cellules qui sont représentatifs de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la National Science Foundation Programme génomique environnementale (Subvention n ° 0723707 EF-).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
Referências
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