تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي
Summary
في هذه المقالة، نحن وصف طريقة استخدام متعددة الأطياف التدفق الخلوي التصوير لقياس استيعاب النانوية polyanhydride أو البكتيريا بواسطة الخلايا 264.7 الخام.
Abstract
ظهرت نظم الجسيمات النانوية وأدوات قيمة في مجال تقديم اللقاحات من خلال قدرتها على تحقيق كفاءة البضائع، بما في ذلك البروتينات، إلى الخلايا مستضد تقديم 1-5. تدخيل النانوية (NP) بواسطة الخلايا مستضد تقديم هو خطوة حاسمة في توليد استجابة فعالة المناعي للمستضد مغلفة. لتحديد كيف يمكن للتغييرات في صياغة جسيمات متناهية الصغر وظيفة الأثر، وسعينا لتطوير إنتاجية عالية، بروتوكول تجريبي الكمية التي كانت متوافقة مع الكشف عن الجسيمات النانوية المنضوية فضلا عن البكتيريا. حتى الآن، وكانت اثنين من التقنيات مستقلة، المجهري والتدفق الخلوي، والأساليب المستخدمة في دراسة البلعمة النانوية. طبيعة إنتاجية عالية من التدفق الخلوي يولد بيانات إحصائية قوية. ولكن نظرا لدقة منخفضة، فإنه فشل لتحديد بدقة المنضوية مقابل النانوية متجهة الخلية. المجهري يولد صورا مع القرار المكانية العالية؛ حowever، وهو مضيعة للوقت وينطوي على أحجام عينة صغيرة 6-8. متعددة الأطياف التدفق الخلوي التصوير (MIFC) هي التكنولوجيا الجديدة التي تتضمن جوانب من كلا المجهري والتدفق الخلوي الذي ينفذ متعددة الألوان الطيفية مجال التصوير مضان ومشرق في نفس الوقت من خلال مجموعة أساسية الصفحي. هذه القدرة يقدم تحليلا دقيقا لشدة إشارة الفلورسنت والعلاقات المكانية بين مختلف الهياكل والميزات الخلوية بسرعة عالية.
هنا، نحن تصف طريقة استخدام MIFC لتوصيف السكان الخلية التي قد استوعبت النانوية polyanhydride أو السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للضرب مصلي. وصفنا أيضا إعداد تعليق جسيمات متناهية الصغر، ووضع العلامات الخلية، واقتناء على نظام X ImageStream وتحليل البيانات باستخدام تطبيق الأفكار. علينا أن نبرهن أيضا تطبيق تقنية التي يمكن استخدامها للتمييز بين ع تدخيلathways للجسيمات الدقيقة والبكتيريا باستخدام مثبط حركة الخلايا-D كما المانع من الأكتين بوساطة البلعمة.
Protocol
Discussion
وقد أظهرت الدراسات التي يمكن أن تستخدم جزيئات قابلة للتحلل على أساس بولي حامض اللبنيك، شارك في الجليكوليك ((PLGA) أو polyanhydrides لتقديم المستضدات مغلفة أو المخدرات إلى الخلايا المستهدفة. استيعاب هذه الجسيمات متناهية الصغر من الخلايا البلعمية من المهم بالنسبة لفعاليتها، م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جائزة ONR-موري (NN00014-06-1-1176) والولايات المتحدة للبحوث الطبية للقوات المسلحة والعتاد القيادة (أرقام المنح W81XWH-09-1-0386 وW81XWH-10-1 0806-) للمالية دعم.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Referências
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
