멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석
Summary
이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.
Abstract
Nanoparticulate 시스템은 항원 제시 세포를 1-5으로, 효율적으로 단백질을 포함하여화물을 전달하는 능력을 통해 백신 전달에 유용한 도구로 등장했습니다. 항원 제시 세포에 의해 nanoparticles의 내면화 (NP)는 캡슐화된 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 생성에 중요한 단계입니다. nanoparticle 제제 영향을 미치는 기능에 어떻게 변경 사항을 확인하려면, 우리는 internalized nanoparticles뿐만 아니라 박테리아를 검출과 호환였다 높은 처리량, 양적 실험 프로토콜을 개발하기 위해 모색하고 있습니다. 현재까지, 두 개의 독립적인 기법, 현미경 및 유동세포계측법는 nanoparticles의 phagocytosis를 연구하는 데 사용되는 방법 왔습니다. 유동세포계측법의 높은 처리량 본질은 강력한 통계 데이터를 생성합니다. 그러나, 낮은 해상도로 인해, 그것은 정확하게 셀 바운드 nanoparticles 비해 internalized 수치 실패합니다. 현미경은 높은 공간적 해상도로 이미지를 생성합니다; However, 그건 시간이 소요되며 작은 샘플 크기에게 6-8을 포함한다. 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 (MIFC)는 판상 코어를 통해 동시에 멀티 컬러 스펙트럼 형광 및 명시야 현미경 이미징을 수행하고 유동세포계측법 양쪽 측면을 통합함으로써 새로운 기술입니다. 이 기능은 형광 신호 강도와 다양한 구조와 고속 세포 기능 사이의 공간적 관계의 정확한 분석을 제공합니다.
여기, 우리는 polyanhydride의 nanoparticles이나 살모넬라 enterica serovar Typhimurium을 internalized 않은 세포 인구를 특성화하기 위해 MIFC을 활용한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 nanoparticle의 현탁액, 세포 라벨, ImageStream X 시스템의 취득 및 아이디어 응용 프로그램을 사용하여 데이터 분석 준비에 대해 설명합니다. 또한 국제화 P를 차별화하는 데 사용할 수있는 기술의 응용을 설명actin – 중재의 phagocytosis의 억제제로서 cytochalasin-D를 사용하여 nanoparticles와 박테리아 athways.
Protocol
Discussion
연구는 폴리 (락트 – 공동 glycolic 산 (PLGA) 또는 polyanhydrides을 기반으로 생분해성 nanoparticles는 대상 세포를 캡슐 항원이나 약물을 전달하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. phagocytic 세포에 의해 이러한 nanoparticles의 이해 이렇게 양적으로 만들어 그들의 효과를 위해 중요하다 . 소설 nanoparticle 전달 시스템을 설계에서 중요한 내면화의 분석이 방법을 사용함으로써는 다양한 세포 유형별로 nano…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 금융에 대한 ONR-MURI 수상 (NN00014-06-1-1176)과 미군 의료 연구 및 Materiel 명령을 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806) 감사드립니다 지원합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Referências
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