Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi
Summary
Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.
Abstract
Nanopartikül sistemleri antijen sunan hücreler 1-5, verimli proteinler de dahil olmak üzere kargo, sağlama yeteneklerine aracılığıyla aşı teslim değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Antijen sunan hücreler tarafından nanopartiküllerin içselleştirilmesi (NP) kapsüllü antijen için etkin bir bağışıklık yanıtı elde edilmesinde kritik bir adımdır. Nanoparçacık formülasyon etkisi işlevi nasıl değişiklikleri belirlemek için, biz içselleştirilmiş nanopartiküller yanı sıra bakteri tespit ile uyumlu olan bir yüksek verimlilik, nicel deneysel protokol geliştirmeye çalıştılar. Bugüne kadar, iki bağımsız teknikleri, mikroskobu ve akım sitometri, nanopartiküllerin fagositoz incelemek için kullanılan yöntemler olmuştur. Flow sitometri ile yüksek verimlilik doğa sağlam istatistiki veriler üretir. Ancak, düşük çözünürlük nedeniyle, doğru bir hücre bağlı nanopartiküller karşı içselleştirmiş ölçmek için başarısız olur. Mikroskopi yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntü üretir; however, zaman alıcı ve küçük örneklem büyüklüğü 6-8 içerir. Çoklu-spektral görüntüleme akım sitometri (MIFC) laminar çekirdek ile eş zamanlı olarak çoklu renk spektral floresans ve parlak saha görüntüleme gerçekleştirir mikroskobu ve akım sitometri hem de yönlerini birleştiren yeni bir teknolojidir. Bu yetenek floresan sinyal yoğunluğu ve değişik yapıda ve yüksek hızda cep telefonu özellikleri arasındaki mekansal ilişkilerin doğru bir analizi sunar.
Bu yazıda, polianhidrid nanopartiküller veya Salmonella enterica serovar Typhimurium içselleştirmiş olmaları hücre popülasyonu karakterize etmek MIFC kullanan bir metodu tanımlar. Ayrıca nanoparçacık süspansiyonları, hücre etiketleme, bir ImageStream X sistemi üzerinde elde edilmesi ve IDEAS uygulamasını kullanarak veri analizi hazırlanmasını açıklar. Ayrıca interne p ayırt etmek için kullanılan bir tekniği uygulaması gösterilmektediraktin-aracılı fagositozunu bir inhibitörü olarak Sitokalazin-D kullanılarak nanopartiküller ve bakteriler için athways.
Protocol
Discussion
Çalışmalar poli (laktik-co-glikolik asit (PLGA) veya polyanhydrides dayalı biyolojik olarak parçalanabilir nanopartiküller Hedef hücrelere kapsüllenmiş antijenler ya da ilaçlar sağlamak için de kullanılabilir olduğunu göstermiştir. Fagositik hücreleri tarafından bu Nanopartiküllerin Uptake böylece niceliksel verme, etkinliğinin için önemlidir . roman nanoparçacık dağıtım sistemlerinin tasarımında kritik içselleştirme analizi bu yöntemi kullanarak, çeşitli hücre tipleri tarafından nan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar için mali ONR-MURI Ödülü (NN00014-06-1-1176) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum destekliyoruz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Referências
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
