Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии
Summary
В этой статье мы опишем метод с использованием нескольких спектральных изображений проточной цитометрии для количественного определения интернализации polyanhydride наночастиц или бактерий RAW 264.7 клеток.
Abstract
Наночастиц системы появились как ценный инструмент в вакцинации благодаря их способности эффективно доставлять грузы, в том числе белков, антиген представляющих клеток 1-5. Интернализация наночастиц (NP) на антиген представляющих клеток является важным шагом в создании эффективного иммунного ответа на антиген инкапсулированные. Чтобы определить, как изменения в функции воздействия наночастиц разработки, мы стремились развивать высокую пропускную способность, количественного экспериментального протокола, совместимое с обнаружением интернализованной наночастиц, а также бактерии. На сегодняшний день два независимых методов микроскопии и проточной цитометрии, были методы, используемые для изучения фагоцитоза наночастиц. Высокая пропускная способность природы проточной цитометрии создает надежные статистические данные. Однако, из-за низкого разрешения, он не точно количественно внутреннюю против клетки связанных наночастиц. Микроскопии генерирует изображения с высоким пространственным разрешением, чowever, это отнимает много времени и включает в себя небольшие размеры образцов 6-8. Multi-спектральных изображений проточной цитометрии (MIFC) является новой технологией, которая включает в себя аспекты как микроскопии и проточной цитометрии, который выполняет многоцветные спектральные флуоресценции и светлого поля изображения одновременно через ламинарный ядра. Эта функция обеспечивает точный анализ интенсивности флуоресцентного сигнала и пространственных отношений между различными структурами и клеточных функций на высокой скорости.
Здесь мы опишем метод с использованием MIFC для характеристики клеточных популяций, которые усвоили polyanhydride наночастиц или Salmonella enterica серовар Typhimurium. Мы также опишем приготовление суспензии наночастиц, мечения клеток, приобретение по системе ImageStream X и анализа данных с использованием идей применения. Мы также продемонстрировать применение метода, который может быть использован для отличать интернализации рathways для наночастиц и бактерий с помощью цитохалазином-D в качестве ингибитора актин-опосредованного фагоцитоза.
Protocol
Discussion
Исследования показали, что биоразлагаемые наночастицы на основе поли (молочной-со-гликолевой кислоты (PLGA) или полиангидриды могут быть использованы для доставки антигенов или инкапсулированных препаратов к клеткам-мишеням. Поглощение этих наночастиц фагоцитирующих клеток имеет важ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить ОНР-MURI Award (NN00014-06-1-1176) и армии США медицинских исследований и материального Command (Грант номера W81XWH-09-1-0386 и W81XWH-10-1-0806) за финансовую поддержки.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Referências
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
