Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem
Summary
Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.
Abstract
Sistemas nanoparticulados surgiram como instrumentos valiosos na entrega de vacina através da sua capacidade para entregar eficientemente carga, incluindo proteínas, para as células apresentadoras de antigénio 1-5. Internalização de nanopartículas (NP) por células apresentadoras de antigénio é um passo crítico na geração de uma resposta imune eficaz para o antigénio encapsulado. Para determinar como as mudanças em função de nanopartículas impacto formulação, buscou-se desenvolver um alto throughput, protocolo quantitativo experimental que era compatível com a detecção de nanopartículas internalizadas, bem como bactérias. Até à data, duas técnicas independentes, microscopia e citometria de fluxo, têm sido os métodos utilizados para estudar a fagocitose de nanopartículas. A natureza de alto rendimento da citometria de fluxo gera robustos dados estatísticos. No entanto, devido à baixa resolução, ele não consegue quantificar com precisão internalizado contra células nanopartículas encadernados. Microscopia gera imagens com alta resolução espacial; however, é demorado e envolve amostras de pequenas dimensões 6-8. Multi-espectrais de citometria de fluxo de imagem (CFMI) é uma nova tecnologia, que incorpora os aspectos de microscopia e citometria de fluxo que executa várias cores de imagem de campo brilhante e fluorescência espectral simultaneamente através de um núcleo laminar. Este recurso fornece uma análise acurada da intensidade de sinal fluorescentes e as relações espaciais entre as diferentes estruturas e funções celulares em alta velocidade.
Aqui, nós descrevemos um método utilizando CFMI para caracterizar as populações de células que têm internalizado nanopartículas polianidrido ou Salmonella enterica sorovar Typhimurium. Descrevemos também a preparação de suspensões de nanopartículas, de rotulagem celular, aquisição de um sistema X ImageStream e análise dos dados usando o aplicativo IDÉIAS. Nós também demonstrar a aplicação de uma técnica que pode ser utilizado para diferenciar o p internalizaçãoathways para as nanopartículas e bactérias por utilizando citocalasina-D como um inibidor da actina mediada por fagocitose.
Protocol
Discussion
Estudos têm demonstrado que as nanopartículas biodegradáveis à base de poli (ácido láctico-co-glicólico (PLGA), ou polianidridos podem ser utilizados para entregar antigénios encapsulados ou drogas às células alvo. Uptake destas nanopartículas pelas células fagocíticas é importante para a sua eficácia, tornando assim quantitativa . análise de internalização crítico na concepção de novos sistemas de entrega de nanopartículas Ao utilizar este método, a absorção diferencial de nanopartículas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Prêmio ONR MURI-(NN00014-06-1-1176) e os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para financeira apoiar.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Referências
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