ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי
Summary
במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.
Abstract
מערכות nanoparticulate התפתחו כמו כלים יקרי ערך במתן חיסון דרך יכולתם יעיל לספק המטען, כולל חלבונים, לתאים מציגי אנטיגן 1-5. ההפנמה של חלקיקים (NP) על ידי תאים מציגי אנטיגן הוא שלב קריטי ביצירת תגובה חיסונית יעילה אנטיגן כמוס. כדי לקבוע כיצד שינויים בתפקוד ניסוח nanoparticle השפעה, ביקשנו לפתח קצב העברת נתונים גבוה, פרוטוקול הניסוי הכמותי שהיה תואם גילוי חלקיקים פנימיים כמו גם חיידקים. נכון להיום, שתי טכניקות עצמאיות, מיקרוסקופיה cytometry זרימה, היו האמצעים שננקטו כדי ללמוד phagocytosis של חלקיקים. טבע קצב העברת נתונים גבוה של זרימת cytometry מפיק נתונים סטטיסטיים חזקים. עם זאת, בשל ברזולוציה נמוכה, הוא אינו מדויק לכמת הפנימו לעומת חלקיקים הנכנס סלולריים. מיקרוסקופיה מייצר תמונות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, However, זה זמן רב וכרוכה גודל מדגם קטן 6-8. רב רפאים הדמיה תזרים cytometry (MIFC) היא טכנולוגיה חדשה המשלבת היבטים של מיקרוסקופיה והן cytometry זרימה שמבצע רב בתחום ספקטרלי צבע דימות פלואורסצנטי ובהיר בו זמנית דרך הליבה למינרית. יכולת זו מספקת ניתוח מדויק של עוצמת אות ניאון ומערכות יחסים מרחביים בין מבנים שונים ותכונות סלולריות במהירות גבוהה.
במסמך זה אנו מתארים שיטת ניצול MIFC לאפיין את אוכלוסיות תאים אשר הפנימו חלקיקים polyanhydride או סלמונלה enterica serovar Typhimurium. כמו כן, אנו מתארים את הכנת תרחיפים nanoparticle, תיוג התא, רכישת במערכת ImageStream X וניתוח של נתונים באמצעות יישום רעיונות. יש לנו גם להדגים את היישום של השיטה, שניתן להשתמש בהם כדי להבדיל עמ 'הפנמהathways עבור חלקיקים וחיידקים באמצעות cytochalasin-D כמעכב של phagocytosis אקטין בתיווך.
Protocol
Discussion
מחקרים הראו כי חלקיקים מתכלה על בסיס חומצה פולי לקטית-Co-גליקולית ((PLGA) או polyanhydrides ניתן להשתמש כדי לספק אנטיגנים כמוס או תרופות לתאי מטרה. הספיגה של חלקיקים אלה על ידי תאים phagocytic חשוב האפקטיביות שלהם, ובכך כמותית . ניתוח של הפנמה קריטי בעיצוב nanoparticle הרומן מערכות אספקת י?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות פרס ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) של צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור כספי תומכים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Referências
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
