Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer
Summary
Time-lapse avbildning används för att bedöma beteendet hos primära preneoplastiska bröst epitelceller från den genetiskt modifierade musmodeller av risken för bröstcancer för att avgöra om det finns samband mellan specifika beteendemässiga parametrar och distinkta genetiska skador.
Abstract
Time-lapse avbildning kan användas för att jämföra beteendet hos odlade primära preneoplastiska bröst epitelceller som härstammar från olika genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer. Till exempel kan tiden mellan celldelningar (cell livslängd), apoptotiska cellantal, utvecklingen av morfologiska förändringar och mekanism av kolonibildning kvantifieras och jämföras i celler som bär specifika genetiska skador. Primära bröstepitelialceller cellkulturer genereras från mjölkkörtlar utan påtaglig tumör. Körtlar noggrant opererande med tydlig separation från angränsande muskler, är lymfkörtlar bort och encelliga suspensioner av anrikad bröst epitelceller genereras av hackning bröstvävnad följt av enzymatisk dissociation och filtrering. Encelliga suspensioner pläterade och placeras direkt under ett mikroskop i en inkubator kammare för levande cell imaging. Sexton 650 nm x 700 nm fält i en 4×4-konfiguration från varje vell av en 6-brunnsplatta avbildas varje 15 min under 5 dagar. Tidsfördröjda bilder undersöks direkt för att mäta cellulära beteenden som kan innefatta mekanism och frekvens av cell kolonibildning inom de första 24 h av utstrykning av cellerna (aggregering kontra cellproliferation), förekomst av apoptos, och fördelningen av morfologiska förändringar. Encelliga spårning används för att generera kartor cellöde för mätning av enskilda celler livslängd och utredning av mönster celldelning. Kvantitativa data statistiskt analyserats för att fastställa om signifikanta skillnader i beteende korrelerade med specifika genetiska skador.
Introduction
Genetiskt modifierade musmodeller är verktyg för att studera och förstå hur olika genetiska skador bidrar till risken att utveckla bröstcancer. Till exempel, har genetiskt modifierade möss visat att kombinationen av tre faktorer: förlust av fullständig längd bröstcancer 1, tidig debut (BRCA1) genen i mammära epitelceller, tumör p53 (TP53) könslinjen haploinsufficiency, och bröstepitelialceller cell riktade uppreglerad Östrogenreceptor alfa (ERA) uttryck resulterar i utvecklingen av bröstcancer i 100% av BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse mammartumörvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyklin transaktivator (rtTA möss med 12 månaders ålder i jämförelse med de lägre procenttal som redovisas i BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – möss utan ERA överuttryck (~ 50 – 60%) och BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre möss utan TP53 haploinsuftivitet (<5%). 1
Dynamisk time-lapse avbildning av beteendet hos preneoplastiska primära bröst epitelceller avslöjar skillnader i cell beteende som är mindre lätt uppskattas i statiska vävnadssnitt. Förändringar i proliferation och differentiering observeras i primära mammarceller från mänskliga bärare BRCA1 mutation. 2 Skapande av encelliga suspensioner av primära bröst epitelceller från normala och genetiskt modifierade möss genereras genom enzymatisk dissociation av resekerade bröstkörtelvävnaden. 3 Time-lapse bilderna ses att bedöma mekanismen och tidpunkten för cell-kolonin utseende och förekomsten av morfologiska förändringar i celler, inklusive epitel-mesenkymala övergång (EMT) och apoptos. Generering av kartor cellöde, är kvantifiering av längden av tiden mellan celldelningar (cell livstider), och bestämning av mönster av celldelning underlättas genom användning av encelliga spårning. TimmS verktyg för spårning (TTT) är allmänt tillgänglig programvara som används för att generera encelliga öde kartor. Dess användbarhet för att belysa mekanismerna för cellens öde har fastställts 4,5 undersöka normala hematopoetisk utveckling stamceller 6-9 och generering av neuroner. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg
Det är viktigt att se till att bröstkörtlar skördas från möss av samma ålder för att kontrollera åldersrelaterad variation i bröstepitelialceller cellbeteende. När utstrykning av cellerna, bör samma antal celler pläteras i varje brunn för varje försök. Celler bör vara relativt glesa när plätering så att kulturerna inte blir konfluenta alltför snabbt gör det möjligt att följa flera enskilda celler genom seriella bilderna. Det är viktigt att plattan är jäm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Bofan Wu och Christian Raithel för tekniskt bistånd och Michael Rieger för hans introduktion till levande cell imaging. Med stöd av NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), försvarsdepartementet W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) program genom National Research Foundation of Korea finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (R31-10.069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Facility Equipment), och NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi och Imaging och djurhälsa delade resurser).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
