Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein
Summary
Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s'il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.
Abstract
En accéléré d'imagerie peut être utilisé pour comparer le comportement de culture primaire des cellules épithéliales mammaires néoplasiques provenant de différents modèles de souris transgéniques de cancer du sein. Par exemple, le temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), le nombre de cellules apoptotiques, l'évolution des changements morphologiques, et le mécanisme de formation de colonies peuvent être quantifiés et comparés dans les cellules portant lésions génétiques spécifiques. Primaires de cellules épithéliales mammaires cultures sont produites par les glandes mammaires sans tumeur palpable. Glandes sont soigneusement réséquée avec une séparation claire de muscle adjacent, les ganglions lymphatiques sont enlevés, et les suspensions monocellulaires de cellules épithéliales mammaires enrichis sont générées par hachage tissu mammaire suivie par dissociation enzymatique et filtration. Simple suspensions de cellules sont ensemencées et placé directement sous un microscope dans une chambre d'incubation pour imagerie des cellules vivantes. Seize 650 um um champs x 700 dans une configuration 4×4 de chaque well d'une plaque à 6 puits sont imagés toutes les 15 minutes pendant 5 jours. Time-lapse images sont directement examinés pour mesurer les comportements cellulaires qui peuvent inclure des mécanismes et la fréquence de la formation de colonies de cellules dans les 24 premières heures d'étalement des cellules (agrégation contre la prolifération des cellules), l'incidence de l'apoptose, et l'échelonnement des changements morphologiques. Une seule cellule de suivi est utilisé pour générer des cartes du destin cellulaire pour la mesure de la durée de vie des cellules individuelles et les enquêtes sur les modèles de division cellulaire. Les données quantitatives sont analysées statistiquement pour évaluer des différences significatives dans le comportement en corrélation avec lésions génétiques spécifiques.
Introduction
Modèles de souris génétiquement modifiées sont des outils pour étudier et comprendre comment les différentes lésions génétiques augmentent le risque de développer un cancer du sein. Par exemple, des souris génétiquement modifiées ont montré que la combinaison de trois facteurs: la perte de la poitrine pleine longueur cancer 1, l'apparition précoce (BRCA1) de gènes dans les cellules épithéliales mammaires, la protéine p53 de tumeur (TP53) haplo-insuffisance de la lignée germinale, et épithéliales mammaires cellule ciblée régulation à la hausse alpha récepteurs d'œstrogènes résultats d'expression (EER) dans le développement du cancer mammaire chez 100% des Brca1 floxé (f) Virus 11/f11/Mouse tumeur mammaire (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tétracycline transactivateur (RTTA souris par âge de 12 mois par rapport aux pourcentages inférieurs rapportés dans Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – souris sans ERa sur-expression (~ 50 – 60%) et les souris BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre sans TP53 haploinsufcacité (<5%). 1
Dynamique imagerie time-lapse de la conduite de pré-néoplasiques primaires cellules épithéliales mammaires révèle des différences dans le comportement des cellules qui sont moins facilement apprécié dans des coupes de tissus statiques. Modifications dans la prolifération et la différenciation sont observées dans les cellules mammaires primaires de l'homme porteuses d'une mutation du gène BRCA1. 2 Création d'une seule cellule suspensions primaires de cellules épithéliales mammaires à la normale et des souris génétiquement modifiées sont générés par dissociation enzymatique du tissu réséqué glande mammaire. 3 Time-lapse les images sont vues à évaluer mécanisme de synchronisation et de l'apparence colonie de cellules et l'incidence des modifications morphologiques dans les cellules y compris transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et l'apoptose. Génération de cartes du destin cellulaire, la quantification de la longueur de temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), et la détermination des modes de division cellulaire sont facilitées par l'utilisation d'une seule cellule de suivi. TimmOutil de suivi de l '(TTT) est un logiciel disponible publiquement utilisé pour générer des cartes destin unicellulaires. Son utilité dans la compréhension des mécanismes de destin cellulaire a été établi 4,5 examiner le développement normal de cellules souches hématopoïétiques 6-9 et la génération de neurones. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques
Il est important de veiller à ce que les glandes mammaires sont récoltées à partir des souris du même âge à contrôler la variabilité liée à l'âge dans le comportement des cellules épithéliales mammaires. Lorsque l'étalement des cellules, le même nombre de cellules doivent être déposées dans chaque puits pour chaque expérience. Les cellules doivent être relativement rares lorsque le placage de sorte que les cultures ne deviennent confluentes tro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Bofan Wu et Christian Raithel pour l'assistance technique et Michael Rieger pour son introduction à l'imagerie des cellules vivantes. Soutenu par le NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Réf. 316 (REN), ministère de la Défense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University), grâce à la Fondation Nationale de la Recherche de Corée financé par le ministère de l'Éducation, de la Science et de la Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (matériel de l'usine rongeurs Barrière), et les NIH NCI 5P30CA051008 (microscopie et d'imagerie et des ressources animales partagées).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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