Время изображений в заданный промежуток первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из генно-инженерных мышей модели рака молочной железы
Summary
Время изображений в заданный промежуток используется для оценки поведения первичной предраковых молочной эпителиальных клеток, полученных из генетически модифицированных мышей моделей риска рака молочной железы, чтобы определить, есть ли корреляция между конкретных поведенческих параметров и различных генетических поражений.
Abstract
Время изображений в заданный промежуток может быть использован для сравнения поведения культурного первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из различных генно-инженерных мышей модели рака молочной железы. Например, время между клеточных делений (ячейка жизни), апоптозе числа клеток, эволюцию морфологических изменений, и механизм образования колоний может быть определена количественно и по сравнению с клетками, несущими специфических генетических поражений. Первичный молочной эпителиальных клеточных культур создаются из молочных желез без ощутимой опухоли. Железы тщательно резекции с четким разделением от соседних мышц, лимфатических узлах удаляют, и одно-клеточные суспензии обогащенных молочных эпителиальные клетки порождаются измельчения ткани молочных желез следует ферментативного разложения и фильтрации. Single-клеточной суспензии высевали и помещаются непосредственно под микроскопом в камере инкубатора для живых клеток изображений. Шестнадцать 650 мкм х 700 мкм поля в конфигурации 4×4 друг от WELL из 6-луночный планшет загружаются через каждые 15 мин в течение 5 дней. Покадровый изображения рассматриваются непосредственно измерить сотовой поведения, которое может включать в себя механизм и частоты образования клеток колонии в течение первых 24 ч посеве клеток (агрегации по сравнению с клеточной пролиферации), частота апоптоза, и постепенно морфологических изменений. Single-клетки слежения используется для создания клеточной судьбы карт для измерения индивидуальной жизни клетки и исследование моделей клеточного деления. Количественные данные статистически проанализированы на предмет существенных различий в поведении связаны с определенными генетическими повреждениями.
Introduction
Генно-инженерные модели мыши являются инструментами, изучить и понять, как различные генетические повреждения вклад в риск развития рака молочной железы. Например, генетически модифицированных мышах показали, что сочетание трех факторов: потеря полнометражный рака молочной железы 1, раннее начало (BRCA1) ген в эпителиальные клетки молочной железы, опухоли белка р53 (ТР53) зародышевой линии гаплонедостаточность и молочной эпителиальных целевые клетки до регулируемого альфа-рецептора эстрогена (ERA) выражение результатов в развитии рака молочной железы в 100% BRCA1 floxed (F) 11/f11/Mouse молочной Вирус опухоли (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( тет-ор) -ER/MMTV-reverse тетрациклин трансактиватор (rtTA мышей в возрасте 12 месяцев по сравнению с более низких процентах сообщили в BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – мышей без эпоху чрезмерной экспрессии (~ 50 – 60%) и BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre мышей без гена ТР53 haploinsufтивность (<5%) 1.
Динамические покадровой визуализации поведения предраковых первичной эпителиальные клетки молочной железы показывает различия в поведении клетки, которые не так легко оценены в статических срезов. Изменения в пролиферации и дифференцировки наблюдается в первичных клеток молочной железы из человеческих носителей мутации BRCA1. 2 Создание одноклеточных суспензий первичных эпителиальные клетки молочной железы из нормальных и генетически модифицированных мышей формируются путем ферментативного диссоциации удаленной ткани молочной железы. 3 замедленной просмотре изображений для оценки механизма и сроков появления клетки колонии и заболеваемости морфологические изменения в клетках, в том числе эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT) и апоптоза. Генерация карт судьбы клеток, количественное промежуток времени между клеточных делений (ячейка жизни), и определение моделей клеточного деления облегчена за счет использования одноклеточных слежения. TimmОтслеживание Tool 'ы (ТТТ) является общедоступной программного обеспечения, используемого для создания одной ячейки карты судьбы. Его полезность для выяснения механизмов клеточной судьбе было установлено 4,5 изучение нормальных гемопоэтических стволовых клеток, развитие 6-9 и генерации нейронов 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги
Важно, чтобы молочные железы собирают из мышей того же возраста, для контроля за возрастной изменчивости молочной эпителиальных поведение клетки. При посеве клеток, такое же количество клеток должны быть покрыты в каждую лунку для каждого эксперимента. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Bofan Wu и христианской Raithel для оказания технической помощи и Майкл Rieger для его введения в живой клетке изображений. Поддерживается NCI, NIH RO1CA112176 (СУП), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (СУП), Deutscher Akademischer Austaush Dienst эВ A/09/72227 Ref. 316 (REN), Министерства обороны W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class Университет) программы через Национальный научный фонд Корея финансируется Министерством Образования, Науки и Технологии (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (грызунов барьер фонда оборудования), и NIH NCI 5P30CA051008 (микроскопии и обработки изображений животных и общих ресурсов).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
