Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno
Summary
Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.
Abstract
Time-lapse imaging può essere usato per confrontare il comportamento di colture primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da diversi modelli murini geneticamente di cancro al seno. Ad esempio, il tempo tra le divisioni cellulari (vite cellulari), i numeri di cellulare per apoptosi, l'evoluzione dei cambiamenti morfologici, e il meccanismo di formazione di colonie possono essere quantificati e confrontati in cellule che trasportano specifiche lesioni genetiche. Colture primarie di cellule epiteliali mammarie sono generati da ghiandole mammarie, senza tumore palpabile. Ghiandole sono accuratamente asportato con una chiara separazione dal muscolo adiacente, linfonodi vengono rimossi, e sospensioni monocellulari arricchite di cellule epiteliali mammarie sono generati sminuzzando tessuto mammario seguita da dissociazione enzimatica e filtrazione. Monocellulari sospensioni vengono piastrate e posti direttamente sotto un microscopio all'interno di una camera incubatore per live-cell imaging. Sedici 650 micron x 700 micron campi in una configurazione 4×4 per ogni well di una piastra da 6 pozzetti vengono esposte ogni 15 min per 5 giorni. Time-lapse immagini vengono esaminati direttamente a misurare i comportamenti cellulari che possono includere meccanismi e la frequenza della formazione delle cellule colonia entro le prime 24 ore di placcatura cellule (aggregazione contro proliferazione cellulare), l'incidenza di apoptosi, e la graduale eliminazione di cambiamenti morfologici. Singola cella di monitoraggio viene utilizzato per generare mappe di cellule destino per la misurazione della durata delle singole celle e le indagini dei modelli di divisione cellulare. I dati quantitativi sono analizzati statisticamente per valutare le differenze significative nel comportamento correlati con specifiche lesioni genetiche.
Introduction
Modelli di topi geneticamente ingegnerizzati sono strumenti per studiare e capire come diverse lesioni genetiche contribuiscono al rischio di sviluppare il cancro al seno. Ad esempio, i topi geneticamente modificati hanno dimostrato che la combinazione di tre fattori: perdita del full-length del cancro al seno 1, ad esordio precoce (BRCA1) gene in cellule epiteliali mammarie, proteina p53 tumore (TP53) della linea germinale haploinsufficiency, e delle ghiandole mammarie epiteliali cellula bersaglio up-regolata estrogeni recettore alfa (ERa) risultati di espressione nello sviluppo del cancro mammario nel 100% dei Brca1 floxed (f) Virus del tumore 11/f11/Mouse mammaria (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse transattivatore della tetraciclina (rtTA topi di 12 mesi di età rispetto alle percentuali più basse riportate in Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – topi senza ERa over-espressione (~ 50 – 60%) e BRCA1 topi f11/f11/MMTV-Cre senza TP53 haploinsufcienza (<5%). 1
Dinamica time-lapse imaging del comportamento di preneoplastiche primarie cellule epiteliali mammarie rivela differenze nel comportamento cellulare che sono meno facilmente apprezzati in sezioni di tessuto statiche. Alterazioni nella proliferazione e la differenziazione sono stati osservati in cellule primarie mammarie dai vettori umani mutazione BRCA1. 2 Creazione di monocellulari sospensioni primarie di cellule epiteliali mammarie normali e di topi geneticamente ingegnerizzati sono generati attraverso la dissociazione enzimatica del tessuto ghiandolare mammario asportato. 3 Time-lapse le immagini vengono visualizzate per valutare meccanismi ed i tempi di comparsa delle cellule delle colonie e l'incidenza di cambiamenti morfologici nelle cellule tra cui transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e l'apoptosi. Generazione di mappe destino cellulare, la quantificazione del periodo di tempo tra divisioni cellulari (cellule vite), e la determinazione di modelli di divisione cellulare è facilitata dall'utilizzo di singola cellula inseguimento. TimmTracking Tool 's (TTT) è un software disponibile pubblicamente usato per generare monocellulari mappe destino. La sua utilità nel chiarire i meccanismi di destino cellulare è stata stabilita 4,5 esaminando normale sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche 6-9 e la generazione di neuroni. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici
È importante garantire che ghiandole mammarie sono raccolti da topi della stessa età per controllare legate all'età variabilità mammaria comportamento delle cellule epiteliali. Quando le cellule placcatura, lo stesso numero di celle deve essere placcato in ogni pozzetto per ogni esperimento. Le cellule devono essere relativamente sparsa quando placcatura in modo che le culture non diventino confluenti troppo rapidamente rendendo possibile seguire più celle individuali …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Bofan Wu e Christian Raithel per l'assistenza tecnica e Michael Rieger per la sua introduzione al live-cell imaging. Supportato da NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 rif. 316 (REN), Dipartimento della Difesa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma attraverso la Fondazione per la Ricerca Nazionale della Corea finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (R31-10069) (PAF ), NIH RR025828 IG20-01 (Barriera Attrezzature Roditore Fondo), e NCI NIH 5P30CA051008 (Microscopia e Imaging Risorse e degli animali condivise).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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